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1. 형광 표지된 T-ALL 세포를 Hoechst 33342로 염색하여 측면 집단 식별
- Hoechst 33342 1:10을 뉴클레아제가 없는 H2O로 희석하여 1 mg/mL 작업 농도를 만듭니다. 염료는 4 °C와 어두운 곳에 보관하십시오.
- 디메틸 설폭사이드(DMSO) 1mL에 49.1mg을 용해시켜 베라파밀 100mM 용액을 준비합니다.
메모: 베라파밀은 ABC 수송체의 억제제이며 측면 개체군 실험을 위한 중요한 대조군입니다. 샘플에 베라파밀을 첨가하면 ABC 수송체가 Hoechst 33342 염료를 유출하는 능력이 억제됩니다. 따라서 실제 측 모집단은 베라파밀이 샘플에 추가될 때 사라집니다.
- 수조를 28°C로 설정합니다.
- 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 튜브에 세포와 용액을 추가하여 어둠 속에서 샘플과 대조군을 준비합니다.
- FACS 튜브에 10개의6 세포, 15μL의 1mg/mL Hoechst 33342 및 2.5μL의 DMSO를 추가하여 샘플을 준비합니다. FBS/PBS를 사용하여 부피를 1mL로 조정합니다.
- FACS 튜브에10개의 6 세포, 15μL의 1mg/mL Hoechst 33342 및 2.5μL의 100mM 베라파밀을 추가하여 대조군을 준비합니다. FBS/PBS를 사용하여 부피를 1mL로 조정합니다.
메모: 최소 10개의6 세포/샘플이 권장되지만, 특히 추가 분석을 위해 측면 집단 세포를 분류하는 경우 더 많은 세포를 염색하는 것이 좋습니다. 106 cells/mL를 초과하지 말고 Hoechst 33342 농도를 15μg/mL로 유지하십시오. 10 x 106 세포가 염색된 경우 총 반응 부피는 10mL입니다.
- 어둠 속에서 28°C 수조에서 120분 동안 배양합니다.
- 배양 후에는 세포를 즉시 얼음 위에 놓고 어두운 곳에 보관하십시오.
- 4 ° C에서 300 x g에서 6 분 동안 셀을 펠렛화합니다. 상층액을 제거합니다. 1mL의 FBS/PBS로 세척합니다.
- 4 ° C에서 300 x g에서 6 분 동안 셀을 펠렛화합니다. 상층액을 제거합니다. 1mL의 FBS/PBS에 세포를 재현탁합니다.
- 세포를 분류할 때까지 4°C를 유지하십시오.
- 세포 분류 15분 전에 FBS/PBS 각 1mL(최종 농도: 2μg/mL)에 2μL의 프로피듐 요오드화물(PI) 스톡(1mg/mL)을 추가합니다. 잘 섞는다.
2. FACS를 사용하여 형광 라벨링된 T-ALL 세포 집단 내의 측면 집단 찾기
- Hoechst 33342 염료 여기(dye excitation)를 위한 UV 레이저와 PI 여기 및 GFP+ T-ALL 세포 검출을 위한 488-nm 레이저가 장착된 세포 분류기에서 염색된 제브라피시 T-ALL 세포 현탁액을 분석합니다.