방법 논문

마이크로 스케일 영양소 레이어에 해양 미생물의 Chemotactic 응답

DOI:

10.3791/203

⸱

2007년 5월 28일

 ,  , 
1Environmental Microfluidics Group, MIT - Massachusetts Institute of Technology

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전단 흐름 내의 곳곳에 영양 씨스 케이프와 박테리아의 수영 동작 이내에 해양 미생물의 chemotactic 식량 약탈을 배워 동작을 공부를위한 microfluidic 채널과 실험에서 구현의 제조가 설명되어 있습니다.

초록

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planktonic의 미생물이 microscale 자원 패치를 악용 수있는 정도 해양 trophodynamics 및 biogeochemical 플럭스에 대한 상당한 영향을 것입니다. 그러나, 수영 미생물이 패치의 가용성과 그들을 찾을 박테리아의 능력을 제한합니다 분자 확산과 난류 전단을 포함한 물리적인 세력의 영향을 극복한다, 바다에 영양 패치를 활용할 수 있습니다. 최근까지, 방법 론적 한계 곳곳에 서식지와 현실적인 소규모 흐름 조건 내에서 미생물의 행동을 직접 시험을 배제했습니다. 따라서 많은 바다 미생물 행동에 관한 현재의 지식은 이론적 예측에서 procured되었습니다. 우리가 만드는 데 사용해야이 microfluidic 장치 (전) 해양 프로세스와 관련된 치수와 잘 퍼지는 특성과 영양 패치를 microscale 그리고 (ii) microscale 개발을 소프트 리소그래피 제조 기술을 적용 바다에 미생물의 식량 약탈을 배워 행동에 새로운 정보를 얻으려면 바다에서 예상되는 것과 해당 전단 속도 vortices. 이러한 microfluidic 장치는 이기종 및 동적 씨스 케이프 내에서 미생물 수영 chemotactic 행동의 첫번째 직접 시험을 허용했습니다. 개인 미생물의 수영장 행동 이외에, 인구 수준 aggregative 반응을 관찰하면서 epifluorescence와 위상 콘트라스트 현미경의 통합 사용, 물리적 치수 및 영양소 패치 잘 퍼지는 특성을 직접 시험을 수 있습니다. 이러한 실험은 식물성 플랑크톤, heterotrophic 박테리아와 phagotrophic protists의 일부 수종은 매우 짧은 시간 프레임 내에 diffusing microscale 자원 패치를 찾기 및 활용에 숙달되는 밝혀있다. 우리는 또한 전단 속도를 중간 그런 나타날, 해양 박테리아는 자신의 협정에서 자신의 환경을 통해 흐름과 수영을 싸울 수 있습니다. 그러나, 임계값 높은 전단 수준을 넘어, 박테리아는 전단 흐름에 부합하고 흐름의 방해없이 수영을 덜 수 있습니다. Microfluidics는 수생 미생물 생태학을 공부를위한 소설과 저렴한 접근을 대표하고, 정확하게 microscale에서 현실적인 흐름 필드와 기판 그라디언트를 만들에 대한 적합성으로 인해, 상호 작용의 가장 작은 비늘에 미생물의 행동 검사에 이상적으로 적용됩니다. 따라서 microfluidics가 바다에 미생물의 생태에 대한 이해를위한 유용한 도구를 대표하는 것이 좋습니다.

프로토콜

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준비

1. 마스크 만들기

CAD 소프트웨어를 사용하여 투명성에 대한 고해상도 인쇄를위한 채널을 디자인합니다. 이것은 "마스크"가 될 것입니다.

클린 룸에서 :

2. 웨이퍼를 청소 구워

아세톤과 함께 첫째, 물총 웨이퍼 후 신속하게 메탄올과 다음 이소프로판올와 함께. 마지막으로, 질소를 사용하여 웨이퍼를 건조.

5 분 오븐 (130 ° C)에서 웨이퍼를 구워.

3. 코팅 웨이퍼에게

스핀 - 코팅 기계의 중앙에 웨이퍼를 놓습니다. 웨이퍼에 병에서 부어 포토 레지스트 (SU - 8). SU - 8의 흐름을하자 ~ 10 S.를위한 휴식 스핀 - coater 켜고 0에서 5의 500 rpm을하기 위해 속도를 램프, 10 S 500 rpm으로 유지, 10 S 이상의 최종 속도를 최대 30 진입로 S.에 대한 최종 속도 유지 최종 속도는 사용 대상 코팅 두께와 SU - 8에 따라 달라집니다. 자세한 사항은에서 찾을 수 있습니다 http://www.microchem.com/

4. 소프트 - 베이크

코팅 후 웨이퍼는 ° C 그리고 95에서 65 먼저 구워 ° C. 베이킹 시간은 사용되는 포토 레지스트의 타겟 두께​​와 종류에 따라 다릅니다. 그런 다음, 웨이퍼 적어도 5 분 실온에서 앉아 보자.

5. 노출

웨이퍼 위에 마스크를 놓고 SU - 8 사용 설명서에서 권장하는 시간 자외선에 웨이퍼를 노출.

6. 포스트 노출 베이킹

65 웨이퍼를 구워 ° C 그리고 95 ° C SU - 8 사용 설명서의 지침에 따라.

7. "마스터"(금형)를 얻기 위해 웨이퍼를 개발

개발자 (PMMA)로 가득 찬 비커를 준비합니다. 포토 레지스트의 unexposed 부분이 씻겨 때까지 매우 부드럽게 비커를 진동하면서 비커에 웨이퍼를 잠그다.

우리가 실험실에서 :

8. PDMS를 준비하고 웨이퍼에 그것을 붓다

한잔에 10시 1분 비율은 치료 요원과 함께 PDMS를 섞는다. 휘저어하고 homogenously 혼합 :이 거품 많이 생성하고 혼합물이 불투명 보이게됩니다. "마스터"의 혼합물을 부어.

9. 진공 챔버의 데 - 거품

거품을 제거하려면 모든 거품들이 갈 때까지 진공 챔버로를 덮고있는 마스터 및 PDMS 혼합물을 배치.

10. 오븐에 베이킹

65 ° C 강화 PDMS에 오븐에 최소한 12 시간 동안 구워.

11. 펀치 구멍

채널 인레츠 및 상점에 대한 마스터 및 펀치 구멍에서 PDMS 보지.

청정실에서 (표시되지 않음)

12. 플라즈마 결합

채널은 PDMS 층 1 분 산소 플라즈마와 함께 유리 슬라이드를 모두 치료 후 유리 슬라이드에 접착됩니다.

실험 :

EXP # 1 : 마이크로 규모의 영양 레이어 해양 미생물의 chemotactic 응답을 조사

1) 실험을 설정

  1. 유리 주사기로 생물과 기판을 추가
  2. 현미경 단계에 microfluidic 채널을 장소와 적절한 인레츠 및 콘센트에 튜브 첨부
  3. 저수지 낭비 튜빙을 연결합니다. 튜브가 완전히 압력 oscillations을 피하기 위해 폐기물 저수지에있는 액체에 빠져들되어 있는지 확인
  4. 플레이스 주사기 펌프에 주사기 및 밸브 및 튜브에 연결
  5. 조명 조건, 배율 등 : 현미경을 설정
  6. 채널 적절한 위치에 초점을
  7. 인공 해수로 가득 큰 주사기를 사용하는 데 - 버블 채널
  8. 주사기 펌프에 적절한 유량을 설정합니다. 이 경우에는 채널에 220 μm의 S -1의 의미 유속에 해당하는 2 ML / 분,

2) 실험을 실행

  1. 채널 영양소 그라디언트를 구축하기 위해 주사기 펌프를 시작합니다
  2. 흐름이 안정하고 영양소의 밴드가 개발되면, 주사기 펌프의 흐름을 중지하고이 시점에서 시간을 기록 시작
  3. 영양 밴드가 옆으로 확산 시작
  4. 정기적인 시간 간격으로 '영화'를 만드는 프레임의 시퀀스를 기록 이미지 분석 소프트웨어를 사용
  5. 오직 움직이는 물체 지금 시각되도록 두 후속 프레임 사이의 시간 차이 이미지를 복용 우리가 아닌 이동 입자와 배경 잡음의 운동성이있는 세포를 차별함으로써 수영 생물을 차별
  6. P 참조와 채널 세포의 위치를​​ 결정하기 위해 영화를보세요영양 패치 osition
  7. 10-20 분 정기적으로 기록 영화는 위치와 생물의 수영 패턴을 분석하는
  8. 다른 프레임 (각 픽셀에 대한 동영상의 기간 동안 해당 픽셀에 기록된 최대 빛의 강도를 지정)에서 생물의 위치를​​ 추가 하시려면 이미지 분석 소프트웨어를 사용함으로써, 우리는 수영 세포에 대한 궤도 정보를 얻을 수 있습니다

EXP # 2 : vortexZ에서 수영 해양 박테리아에 전단의 효과를 조사

  1. 다른 채널 기하학 사용하여, 우리는 다른 전단 속도로 소용돌이에서 수영 박테리아의 행동을 관찰할 수

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토론

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해양 미생물들이 지역의 화학 및 물리적 환경과 상호 작용하는 방법을 이해하는 바다의 영양분과 탄소 순환 (Azam 및 Malfatti 2007)에서 planktonic 미생물의 역할을보다 완벽하고 정확한 인식을 위해 필수적입니다. 그러나 많은 중요한 미생물의 상호 작용이 이루어지는있는 동안 작은 비늘 (<㎜)로 인해, 기술적 제한이 이종 바이오 physico - 화학 풍경 내에서 미생물의 동작에 대한 자세한 시험을 예방할 필요하면 바다에서 수영 미생물에 의해 경험으로 예측했다. microfluidics의 최근 발전 (와이트 외. 2001) 복잡한 microhabitats 내에서 미생물의 생태에 대한 자세한 분석을 활성화 (주석 외. 2003 년 파크 외. 2003 카이머 외. 2006 년 마르코스와 스타커 2006). microfluidic 장치는 단일 세포 수준에서, (. 블랙번 외 1997, 1998) 우리 diffusing 영양 패치에 해양 미생물의 모두 chemotactic 응답을 검사하기 위해 허용 여기에 설명된와 난류 전단 내에서 미생물의 수영 동...

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감사의 글

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우리는 깨끗한 객실 시설이 비디오의 필름 부분에 우리를있게 위해 MIT에서 마이크로 시스템즈 기술 연구소 감사하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PDMS, Sylgard 184실리콘 엘라스토머 키트Dow Corninghttp://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100포토레지스트MicroChem Corp.www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E 도립 현미경현미경Nikon Instruments
PEEK 튜빙 (0.762 mm ID, 1.59 mm OD)도구Upchurch Scientificwww.upchurch.com
주사기 (Luer-Lok 팁)도구BD Biosciences
피팅 파트 P-704-01도구Upchurch Scientific튜빙을 Luer-Lok 팁 주사기에 연결하기 위한 용도
주사기 펌프 (PHD 2000 프로그래밍 가능)장비Harvard Apparatus
CCD 카메라 (PCO 1600)장비Cook

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  2. Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
  3. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
  4. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
  5. Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
  6. Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
  7. Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
  8. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).

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