췌장섬 접목: 생체 내 이미징을 위해 췌장섬을 마우스 눈의 전방에 이식하는 방법

초록

출처: Nilsson, J.et. al.안구 전방에서 인간 췌장섬 이식 및 기여 숙주 세포의 종단적 생체 내 이미징 및 정량화. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 생체 내에서 인간 췌장 이식편의 혈관 재생화를 모니터링하기 위해 인간 췌장도를 마우스 눈의 전방에 이식하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 이식편의 캡슐화 및 혈관화를 촉진하는 데 있어 수용자 세포와 기증자 세포의 기여도를 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 jove 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다

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1. 이식 장비 및 수술 테이블 준비

참고: 모든 수술 도구는 고압멸균되어야 하며 수술대와 기구는 70% 알코올로 소독해야 합니다.

1. 코 마스크를 통해 입체 헤드 홀더를 마취에 연결하고 발열 패드를 켭니다.
2. 기밀 해밀턴 주사기를 폴리에틸렌 튜브와 뭉툭한 끝 눈 캐뉼라에 연결합니다.
   메모: 조립하기 전에 모든 부품을 PBS로 채우는 것이 좋습니다. 갇힌 기포가 있는지 확인하고 있는 경우 제거합니다.
3. Hamilton 주사기를 테이블(그림 1a) 또는 이동식 베이스(그림 1e)에 단단히 부착하고 캐뉼라를 늘어뜨린 상태(즉, 대기 위치)로 튜브를 실체 현미경에 부착합니다.
   메모: 수술용 테이프는 쉽게 제거하고 다시 부착할 수 있으므로 사용하십시오.
4. 0.1mg/kg 부프레노르핀 용액으로 채워진 30G 바늘에 연결된 1mL 주사기를 준비합니다.
5. 멸균 PBS가 있는 주사기를 준비합니다. 또는 피펫을 사용하십시오.
6. 난방 램프가 있는 깨끗한 웨이크업 케이지를 따로 보관하십시오.

2. 수술을 위한 수혜 마우스의 마취 및 위치 지정

참고: 모든 동물은 룬드 대학의 동물 시설에서 병원체가 없는 환경에서 사육되고 유지되었습니다.

1. 40% O₂/60% N₂/3% 이소플루란으로 채워진 챔버에서 마우스를 마취하고 마취된 마우스를 따뜻한 가열 패드의 헤드 홀더 플랫폼으로 옮깁니다(그림 1a). 페달 반사 신경이 부족한지 확인하십시오.
   메모: 이소플루란 마취는 수술 후 빠른 회복을 위해 선호되는 마취 방법입니다. 이소플루란을 사용하려면 현미경실에 적절한 환기가 이루어져야 합니다.
2. 마우스의 주둥이를 40% O₂ /60% N₂ 0.9%–1.5% 이소플루란 마취기에 연결된 마취 마스크에 넣습니다. 엄지와 손가락을 사용하여 머리를 약간 들어 올리고 측면의 금속 조각을 사용하여 고정합니다. 이어피스가 머리를 귀 바로 아래에 고정하는지 확인하십시오. 0.1mg/kg 부프레노르핀 용액을 마우스 뒷면에 피하주사합니다.
   메모: 부프레노르핀은 진통제로 사용됩니다.
3. 수술할 눈이 위를 향하고 연구자에게 가까이 오도록 머리를 기울입니다.
4. 뭉툭한 집게를 사용하여 이식할 눈꺼풀을 부드럽게 집어넣고 눈을 빼낸 다음 핀셋으로 느슨하게 고정합니다. 핀셋의 끝이 헤드 홀더 플랫폼에 부착된 폴리에틸렌 튜브로 덮여 있는지 확인합니다(그림 1a, 삽입).
5. 멸균 PBS 한 방울을 눈에 바르면 항상 양쪽 눈을 적시십시오.
6. 밀봉된 1.5mL 튜브(섹션 1)에서 멸균 PBS가 있는 페트리 접시로 인간 섬을 옮기고 섬이 서로 가까이 있어 세포 배양 배지 전달량을 최소화합니다(그림 1c).
7. 폴리에틸렌 튜브를 통해 Hamilton 주사기에 연결된 눈 캐뉼라에서 ~20-30개의 섬을 집습니다.
   메모: 섬과 함께 가능한 한 적은 액체를 섭취하십시오.
8. 튜브를 거꾸로 매달아 실체 현미경에 부착합니다(그림 1d). 튜브를 조심스럽게 테이프로 감아 섬이 캐뉼라쪽으로 튜브 끝으로 가라앉도록 합니다.

3. 이식 절차

참고: 이 방법은 이전에 마우스 섬의 이식을 위해 설명되었습니다. 약간 수정된 절차가 여기에 나와 있습니다.

1. 뒷다리의 패드를 꼬집어 마우스가 잠들었는지 확인합니다.
2. 혈류를 방해하지 않고 눈을 구속하는 겸자를 조이고 멸균 PBS 한 방울을 눈에 바릅니다.
3. 25g의 바늘을 메스로 사용하여 위쪽으로 비스듬하게 깎아서 각막 끝의 절반만 조심스럽게 관통하고 옆으로 한 번 절개합니다. 위쪽 각도로 구멍을 만드십시오. 이식 후 구멍이 더 쉽게 밀봉됩니다(그림 1f).
4. 섬이 미리 로드된 캐뉼라로 각막을 조심스럽게 들어 올리고 눈에 섬을 천천히 바릅니다. 홍채의 손상을 방지하기 위해 캐뉼라를 전방에 삽입하지 말고 각막 입구를 조심스럽게 밀어 넣습니다(그림 1g).ACE.
   에서 캐뉼라를 천천히 집어넣습니다. 메모: 3–8 μL의 주입량을 목표로 합니다. 부피가 너무 크면 눈이 불필요하게 높은 안압에 노출되고 주입된 섬이 전방에서 역류할 수 있습니다.
5. 안나의 압력 증가로 인해 섬 삽입에 어려움이 있는 경우 측면 절개 부위를 보강하여 절개 부위를 확대하고 섬을 다시 적용합니다.
   메모: 때때로, 도입된 기포는 공간 홀더로 사용될 수 있습니다.
6. 아이 젤을 눈에 바르고 눈을 구속하는 겸자를 풀고 이소플루란에 있는 마우스를 8-10분 동안 같은 위치에 두어 섬이 굳을 때까지 기다립니다.
7. 눈꺼풀을 잡고 있는 집게를 제거하고 눈꺼풀을 원래 위치로 되돌립니다.
8. 헤드 홀더에서 마우스를 제거하고 웨이크업 케이지로 옮깁니다.
9. 마우스가 깨어 있고 움직이면 원래 케이지로 다시 옮기고 스캔할 때까지 동물 사육장에 보관하십시오(최소 5일 권장).

결과

그림 1: 췌장섬을 안구의 전방으로 이식하는 것.
(a) 마취된 마우스가 정위 헤드 홀더에 고정되고 노출된 눈(삽입물)이 테이블에 고정된 준비된 해밀턴 주사기 옆에 있고 실체 현미경이 마우스 섬(b) 또는 인간 섬(c)을 선택할 준비가 되어 있는 것을 보여주는 이식 설정. (d) 섬이 적재된 눈 캐뉼라의 대기 위치. (e) 진행 중인 이식 및 (f) 눈 끝으로 각막을 조심스럽게 들어 올리고 섬을 전방으로 분배하는 데 사용되는 단일 측면 절개의 개략도(g). 마우스 섬(h) 또는 인간 섬(i)을 주입한 직후의 눈 이미지. 스케일 바 = 500μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
클린 벤치 코트
발열 패드			37 °C로 설정
Ivis Lumina ll 생물 발광 이미저	캘리퍼스		대체 생물 발광 이미징 시스템으로는 In vivo F PRO(Carestream) 및 Photon Imager(Biospace Lab)가 있습니다.
가위 해부
홍채 겸자(톱니형)
바늘 홀더
27G 0.3ml 인슐린 주사기	테루모	T35525M2913