오가노이드 전기천공법(Organoid Electroporation): 플라스미드 DNA를 위장 오가노이드(Gastrointestinal Organoid)로 transfection하는 방법

초록

출처: Gaebler, A. M.et al.위장 오가노이드의 유전 공학을 위한 보편적이고 효율적인 전기천공 프로토콜. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 췌관 선암종(PDAC), 대장암(CRC), 담관암(CCC) 및 위암(GC) 오가노이드와 같은 다양한 개체에서 보편적인 기능을 입증하기 위해 대형 플라스미드를 3차원 위장 오가노이드로 형질주입하는 전기천공법 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 오가노이드 배양 및 전기천공 전 제제

1. 앞서 설명한 바와 같이 조직 분해에 의해 오가노이드를 확립하고 기저 매트릭스 개요에서 해당 개체 특정 배양 배지로 확장하십시오(표 1 및 Table of Materials
   참조). 메모: 인체 조직 샘플의 경우 윤리 위원회의 연구에 대한 정보에 입각한 동의와 승인이 필요합니다.
2. 전기천공법 후 파스딩을 위해 37°C에서 48웰 플레이트를 예열합니다.
3. 10 μM Y-27632 및 3 μM CHIR99021.
   를 포함한 항생제가 없는 개체 특이적 오가노이드 배양 배지(표 1 참조)뿐만 아니라 항생제가 없는 기저 배지를 준비합니다. 메모: 항생제의 중단은 독성 영향을 줄이는 데 중요합니다. Y-27632 및 CHIR99021 세포 회수를 개선합니다.
4. 오가노이드 준비(그림 1 참조)
   1. 배양 배지에서 전기천공법 샘플당 48웰 플레이트에서 5웰의 오가노이드를 배양합니다
      메모: 증식성 오가노이드를 사용해야 합니다(마지막 분할 후 약 2-3일).
   2. 웰당 10μM Y-27632를 포함하여 230μL의 해리 시약(재료 표 참조)을 준비합니다.
   3. 각 웰에서 배양 배지를 제거하고 준비된 해리 혼합물 230μL에서 오가노이드를 기계적으로 해리합니다. 전기천공법 시료당 5웰을 하나의 15mL 튜브에 풀링합니다.
   4. 볼텍싱으로 혼합하고 10-15 개의 세포 클러스터가 발생할 때까지 37 ° C에서 5-15 분 동안 배양합니다. 따라서 해리를 미시적으로 확인하십시오. 최대 10mL까지 항생제 없이 기초 배지를 추가하여 분해를 중지합니다.
      메모: 이 단계는 매우 중요합니다! 배양이 너무 짧을 때 전기천공법(electroporation) 효율은 감소하지만 소화가 길면 생존율이 떨어집니다.
   5. 실온에서 5분 동안 450 x g의 원심분리기를 사용하고 상층액을 버리고 4mL의 전기천공법 완충액으로 2회 세척합니다(재료 표 참조).

2. 전기천공법

참고: 다음 프로토콜은 구형파와 분리된 기공 및 전달 펄스 시퀀스가 가능한 전기천공자를 위해 개발되었습니다(그림 2 참조). 선택적으로, 임피던스 값뿐만 아니라 샘플로 전송되는 전압, 전류 및 에너지를 재현 가능한 실험을 위한 제어로 측정할 수 있습니다.

1. 30μg의 플라스미드 DNA를 함유한 100μL의 전기천공(재료 표 참조)에 오가노이드 펠릿을 재현탁
   메모: 사용된 플라스미드 DNA의 농도는 전기천공법 과정에서 최적의 염 농도를 위해 5 μg/μL를 초과해야 합니다. 따라서 벡터 준비를 위한 endofree plasmid maxi kits(재료 표 참조)가 권장됩니다. 총 45μg의 DNA를 세포독성 효과 없이 사용할 수 있습니다.
2. 기포를 생성하지 않고 완전한 DNA-오가노이드 혼합물을 2mm 갭 너비의 전기천공레이션 큐벳에 분주합니다.
3. electroporation 매개변수를 설정합니다(표 2, 그림 2 참조).
4. 거품이 나지 않도록 손가락으로 큐벳을 두드려 세포를 약간 섞습니다. 큐벳을 큐벳 챔버에 놓습니다.
5. electroporator의 Ω 버튼을 누르고 임피던스 값을 기록해 두십시오.
   메모: 30-40 Ω 사이의 임피던스가 최상의 결과를 보여주었습니다. 일반적으로 30-55 Ω 사이여야 합니다. 그렇지 않은 경우 사용된 큐벳의 갭 너비, 전기천공기의 케이블 연결, 가능한 기포, 전기천공 혼합물의 정확한 부피 및 염분 농도를 제어하십시오.
6. 시작 버튼을 눌러 electroporation 프로그램을 실행하고 전류, 전압 및 에너지 값을 제어합니다.
   메모: 측정된 전압, 전류 및 에너지의 값은 설정된 electroporation 매개변수와 일치해야 합니다. 반복되는 실험을 비교할 때 이러한 데이터를 기록해 두는 것이 도움이 될 수 있습니다.
7. 전기천공 후 즉시 항생제 없이 500μL의 배양 배지를 추가합니다(CHIR99021 및 Y-27632 포함, 1.3단계 참조). 흰색 거품을 해리하기 위해 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
   메모: 백색 거품은 electroporation 과정 후에 나타나고 상당한 수의 세포가 부착됩니다. 따라서 세포를 잃지 않기 위해 해리가 매우 중요합니다.
8. 전기천공법 큐벳에 있는 피펫을 사용하여 큐벳에서 새 15mL 튜브로 샘플을 완전히 옮깁니다(재료 표 참조). 나머지 세포를 얻기 위해 기저 배지로 큐벳을 다시 헹구는 것이 좋습니다.
9. 세포의 재생을 위해 실온에서 40분 동안 배양합니다.

3. 셀의 시딩

1. 실온에서 450 x g의 세포를 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
2. 펠릿을 100μL의 기저 매트릭스에 재현탁시키고 예열된 48웰 플레이트에 20μL 방울을 시딩합니다(1.2단계 참조). 중합을 위해 37°C에서 10분 동안 배양하고 Y-27632가 보충된 250μL의 배양 배지를 첨가하고 성장한 오가노이드의 다음 분할(약 5-7일)까지 CHIR99021합니다.

4. Transfection 효율 측정

참고: 일반적으로 추가적인 transfection control로 형광 marker가 있는 벡터를 electroporate하는 것이 좋습니다. 선택한 마커와 발색단 성숙에 따라 형광은 transfection 후 약 24-48시간 이내에 볼 수 있습니다18.

1. transfection control에서 24-48시간 후 형광을 현미경으로 확인합니다(그림 3B).

표 1: 기초 배지, 소화 혼합물 및 배양 배지의 구성.

기초 매체 성분:	나는	제2장
고급 DMEM/F-12	-	-
글루타맥스	1배	1배
헤페스	10 밀리미터미터	10 밀리미터미터
페니실린 스트렙토마이신	-	1배
프리모신	1배	-

소화에 의한 설립
소화 혼합물:	결장		위		간		췌장
	보통	종양	보통	종양	보통	종양	보통	종양
콜라겐분해효소 II	-	-	-	-	-		0.625 mg/ml
콜라겐분해효소 XI	-	0.1 밀리그램 / 밀리람베르트	-	0.1 밀리그램 / 밀리람베르트	-		-
콜라겐분해효소 D	-	-	-	-	2.5 mg/ml		-
디스플레이 II	-	1 밀리그램 / 밀리람베르트	-	1 밀리그램 / 밀리람베르트	-		2.5 mg/ml
DNase I	-	-	-	-	0.1 mg/ml		-
에디타	2중	-	10미디엄	-	-		-
에 희석되는	킬레이트 완충액*	기초 매체 I	킬레이트 완충액*	기초 매체 I	EBSS에서		기초 매체 I
배양을 위한 것:	얼음 위에서 0.5시간	37°C에서 1시간	RT에서 0.25-0.5시간	37°C에서 1시간	37°C에서 0.5-1시간	37°C에서 1.5시간	37°C에서 0.5-1	37°C에서 2-3시간
참고문헌에서 발췌:	Sato et al. 2011		Bartfeld et al. 2015		Broutier et al. 2016		Hennig et al. 2019

재배 매체 (기본: 기초 매체 II)
대답83-01	0.5 μM의	2 μM	5 μM	0.5 μM
나27	1배	1배	1배	1x
비타민 A가 없는 B27	-	-	1배	-
포스콜린	-	-	10 μM	-
hFGF-10	-	200 ng / ml	100 ng / ml	100ng/ml
hHGF	-	-	25 ng / ml	-
[Leu15] 가스트린	10nM	1nM	10nM	10 nM
메가에프	50 ng / ml	50 ng / ml	50 ng / ml	50 ng / ml
엔2	-	-	1배	-	1배
N-아세틸-L-시스테인	1.25 밀리미터.	1 밀리엠	1 밀리엠	1 밀리엠
니코틴아미드	10 밀리미터미터	10 밀리미터미터	10 밀리미터미터	10 밀리미터미터
머리	10의 %	10의 %	-	10 %
프리모신	1배(100μg/ml)	1배(100μg/ml)	1배(100μg/ml)	1x(100μg/ml)
프로스타글란딘 E2	10nM	-	-	-	1 μM
르스폰딘	20 %	10의 %	10의 %	10 %
SB202190	3μm	-	-	-
Wnt3A	50 %	50 %	-	50 %
*킬레이트 완충액: 5.6 mM Na2HPO4, 8.0 mM KH2PO4, 96.2 mM NaCl, 1.6 mM KCl, 43.4 mM 자당, 54.9 mM d-소르비톨, 0.5 mM dl-디티오트레이톨 증류수 중

결과

그림 1: Electroporation 준비 워크플로우. 첫째, 오가노이드는 10-15개의 세포 클러스터로 해리되어야 하며 항생제는 씻겨 나가야 합니다. 전기천공법 후에 백색 거품은 해리될 필요가 있습니다. 세포는 실온에서 40분 동안 재생한 후 파종할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
[Leu15] 가스트린	시그마-알드리치	G9145
대답83-01	토크리스 바이오사이언스	2939
고급 DMEM/F-12	인비트로젠	12634010
나27	인비트로젠	17504044
B27 보충제, 비타민 A 제외	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12587010
CHIR99021	줄기 탐지기	2004년 4월
콜라겐분해효소 II	생명 기술	17101-015
콜라겐분해효소 XI	시그마-알드리치	C9407-100MG
콜라겐분해효소 D	로슈	11088866001
디스플레이 II	로슈	4942078001
드나세 I	시그마-알드리치	D5319
D-소르비톨	로스	6213.1
디티오트레이톨	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	1859330
에디타	로스	8040
포스콜린	토크리스 바이오사이언스	1099
글루타맥스	생명 기술	35050061
헤페스	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15630106
hFGF-10	프리프로텍	100-26
케이클	시그마-알드리치	P9541
KH2PO4	로스	3904.2
마트리겔	코 닝	356231	지하 매트릭스
메가에프	인비트로젠	PMG8043
엔2	인비트로젠	17502048
염화나트륨	로스	3957.1
나2HPO4	로스	케이300.2
N-아세틸-L-시스테인	시그마-알드리치	A9165
니코틴아미드	시그마-알드리치	N0636
머리	북미	북미	HEK293 세포(Hek293- mNoggin-Fc)에서 생산된 조건화 배지
재조합 인간 HGF	프리프로텍	100-39시간
르스폰딘	북미	북미	HEK293 셀(HA-Rspo1-Fc-293T)에서 생산된 컨디셔닝 배지
SB202190	시그마-알드리치	S7067
TrypLE 익스프레스	지브코	12604021	해리 시약
Wnt3A	북미	북미	L-Wnt3a 세포에서 생산된 조건화된 배지(Sylvia Boj에서 추출)
Y-27632	시그마-알드리치	Y0503
48웰 플레이트	코 닝	3548
Nepa Electroporation 큐벳 2mm 갭 w/피펫	공급자:Nepa Gene Co., Ltd.	EC-002S
전기포레이터 Nepa21	공급자:Nepa Gene Co., Ltd.	북미
EVOS FL 자동	인비트로젠	AMAFD1000	형광 현미경
EndoFree 플라스미드 맥시 키	키아겐	12362
옵티-MEM	지브코	31985047	전기천공법 완충액
2 gRNA concatemer 벡터	애드진	84879
PX458 플라스미드	애드진	48138	sgRNA 및 Cas9 코딩
px458_Conc2 플라스미드	애드진	134449	두 개의 서로 다른 sgRNA를 위한 2x U6 promotor를 함유한 px458 플라스미드

년 ) 년 ) 년 년 ) 년 (영문) 【무수정유출】 년 년