췌장 종양에서의 생체 외 T 세포 자극: T 세포에서 사이토카인 생산을 증가시키는 방법

초록

출처: Spear, S., et al. 정소성 췌장 종양의 생성 및 종양 침윤 T 세포 독성의 생체 외 특성화. J. Vis. 특급 (2019).

이 기사는 T 세포에서 인터페론-감마 또는 IFN-감마 및 종양 괴사 인자-알파 또는 TNF-알파와 같은 사이토카인의 세포 내 농도를 증가시키기 위한 생체 외 T 세포 자극 기술에 대해 설명합니다. 이러한 사이토카인은 효과적인 항종양 반응을 매개하며 종양에서 치료 역할을 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 췌장 종양의 소화

1. 절개된 췌장 종양, 전이성 부위 종양 또는 건강한 췌장 조직을 얼음처럼 차가운 PBS에 넣고 얼음에 보관합니다.
   1. 집게를 사용하여 종양을 페트리 접시에 옮깁니다.
   2. 5.0mL의 소화 배지(2mg/mL 콜라겐분해효소, 0.025mg/mL DNase RPMI)를 50mL 튜브에 첨가하고 효소 활성이 시작되는 것을 방지하기 위해 얼음에 보관합니다.
      메모: 이 프로토콜은 ≥1 units/mg FALGPA 및 > 125 collagen digestion units (CDU)/mg solid의 활성을 가진 Collagenase Type V를 사용합니다. 콜라겐 분해 효소 및 DNase 부분 표본은 -20 °C에서 보관하고 사용하기 전에 얼음에서 해동할 수 있습니다. 둘 다 멸균 RPMI에 완전히 용해되면 0.2μm 필터를 통과시켜 오염 물질을 제거할 수 있습니다. 콜라겐 분해 효소는 재료 손실을 방지하기 위해 여과하기 전에 완전히 용해되어야 합니다.
   3. 페트리 접시의 종양을 덮기 위해 이 용액의 작은 부분 표본을 취하십시오.
   4. 멸균 메스와 집게를 사용하여 종양을 대략 3mm 미만의 작은 조각으로 자릅니다.
   5. 종양 조각을 튜브에 긁어내고 모든 조각이 소화 매체에 잠길 때까지 튜브를 부드럽게 뒤집습니다. 다른 종양 샘플을 배치로 준비해야 하는 경우 얼음에 보관하십시오.
   6. 37°C에서 20분 동안 진탕 장치로 옮깁니다.모든 종양 조각이 물에 잠겨 있고 튜브 가장자리에 달라붙지 않았는지 확인합니다. 흔들 수 없는 경우 소화를 돕기 위해 5분마다 샘플을 볼렉스합니다.

2. 소화된 종양으로부터 단세포 현탁액의 준비

1. 분해 단계 직후 튜브를 얼음 위에 올려 효소 활동을 늦춥니다.
   1. EDTA를 추가하여 20mM의 최종 농도를 달성하고 샘플을 간단히 소용돌이하여 혼합합니다. 이것은 효소 활동을 더욱 늦출 것입니다.
   2. 튜브를 열고 새 RPMI 배지로 튜브 뚜껑에서 종양 소화물을 헹굽니다.
   3. 얼음 위에서 50mL 개방형 튜브에 70μm 스트레이너(스트레이너의 μm 크기는 원하는 대로 변경할 수 있음)를 준비합니다.
   4. 필터를 매체로 미리 적십니다.
   5. 소화된 세포를 재현탁하고 25mL 이상의 스트라이프를 사용하여 튜브의 측면을 세척합니다. 스트라이프의 넓은 개구부는 두꺼운 다이제스트가 쉽게 통과할 수 있도록 하는 데 중요합니다.
   6. 25mL 스트라이프를 사용하여 모든 다이제스트를 스트레이너로 옮깁니다.
   7. 1mL 주사기 플런저를 사용하여 필터 상단의 종양을 으깬다. 세포에 대한 전단 응력을 최소화하기 위해 위아래로 직접 매싱합니다.
   8. RPMI로 스트레이너를 통해 세포를 지속적으로 세척합니다. 세포가 통과할 수 있을 만큼 충분한 힘으로 씻으십시오.
   9. 으깰 재료가 아직 있지만 RPMI가 플러싱을 멈추면 스트레이너가 포화됩니다. 따라서 샘플을 새 필터로 옮기고 continue.
      메모: 결국 세포외 기질 성분만 필터에 남게 되며, 모든 단일 세포는 통과해야 합니다.
2. 튜브를 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   1. 세포 펠릿을 완전한 RPMI로 조심스럽게 재현탁시키고 다른 필터를 직접 통과시켜 적절하게 재현할 수 없는 세포 외 기질 또는 큰 세포 덩어리를 제거합니다.
   2. 이 시점에서 자극이 필요하지 않은 경우 300 x g 및 4 °C에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하여 유세포 분석을 위해 분리된 세포를 즉시 염색합니다. 플레이트를 한 번의 날카로운 움직임으로 거꾸로 튕겨 상층액을 제거합니다. 또는 동결 매체(FBS의 10% DMSO)에 재현탁하고 -80°C에서 보관한 다음 액체 질소에 장기간 보관합니다.
      메모: 동결 단계는 나중에 면역 세포를 정화할 수 있습니다. 그러나 면역 세포 subset의 정량화는 세포 수와 표현형이 동결/해동 과정의 영향을 받지 않는지 확인하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다. 체외 T세포 자극은 신선한 종양 샘플에서 가장 잘 수행됩니다. 이 시점에서 시료는 필요한 경우 비드 기반 사자 세포 제거 또는 면역 세포 농축 분석을 통해 추가로 정제할 수 있습니다.

3. 체외 자극을 위한 세포 준비

1. 완전한 배지(RPMI 10 % FBS, 1X 페니실린 및 1X 스트렙토마이신)에서 2 x 10⁶/ 100 μL의 농도를 얻기 위해 세포를 계수합니다.
   메모: 도금된 총 세포의 수가 많기 때문에 이 샘플 내에 분석하기에 적절한 T 세포가 있음을 보장합니다. 그러나 이 수치는 시료 가용성과 관심 있는 T 세포 하위 집합의 희귀성에 따라 확장되거나 축소될 수 있습니다.
   1. 100μL의 세포를 U-바닥 96웰 플레이트에 플레이트합니다.
   2. PMA/ionomycin의 2배 제제를 포함하는 완전한 배지 100μL를 추가합니다(제조업체에서 권장하는 대로 각각 최종 농도 0.081μM 및 1.34μM를 달성하기 위해).
      메모: 탈과립화/엑소사이토시스를 측정하는 경우, 여기에 배지에 형광 접합 안티 마우스 CD107a도 포함시키십시오. CD107a가 포함되지 않은 대조군 샘플도 수행해야 합니다.
   3. 37 ° C 인큐베이터에 5 % CO₂로 1 시간 동안 놓습니다.
   4. 완전한 배지에서 브레펠딘 A 및 모넨신의 10x 제제 20 μL를 추가합니다(최종 농도 1.06 μM 및 2.0 μM(제조업체에서 권장)를 각각 달성합니다.
      메모: Brefeldin A와 monensin은 단백질 수송 억제제이므로 사이토카인 등의 세포 외 방출을 차단하여 유세포 분석으로 검출할 수 있습니다. ELISA 또는 유사한 방법으로 상층액으로의 사이토카인 방출을 측정하는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
   5. 플레이트를 37% CO₅가 있는 2°C 인큐베이터에 4시간 동안 더 놓습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
70μm 공극 크기 셀 스트레이너	피셔 사이언티픽	11597522
안티 CD107a PE (클론 1D4B)	바이오레전드	121612	1:100 문화 미디어에
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A4503
세포 자극 칵테일 (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 및 ionomycin)	이바이오사이언스	전화: 00-4970-03	x 최종 농도 PMA 0.081 μM, 이오노마이신 1.34 μM
THP1 인간 단핵구 백혈병 세포	증권 시세	TIB-202
Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해 효소 V 형	시그마-알드리치	C9263	2 mg/mL 매체 내
디메틸 설폭 사이드(DMSO)	시그마-알드리치	D2650-100mL
DNase(소 췌장 II-S형에서 추출한 Deoxyribonuclease I)는 0.15M NaCl에 10mg/mL를 보유하고 있습니다	시그마-알드리치	D4513	분해 매체의 최종 농도 0.025 mg/mL
태아 송아지 혈청(FCS)	GE 헬스케어	대답15-104	RPMI에서 10%
Hamilton 시린지 700 시리즈, 25 μL 용량, 22s 게이지 니들 베벨 팁	피셔 사이언티픽	10100332
페니실린/스트렙토마이신	파아	15140122	100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신
단백질 수송 억제제 칵테일(500개)(브레펠딘 A 및 모네신)	이바이오사이언스	전화: 00-4980-03	1x 최종 농도 Brefeldin A 10.6 μM, 모넨신 2 μM
RPMI-1640 (글루타민 0.3g/L 함유)	시그마-알드리치	R8758
외과용 메스 칼날 No.10	스완-모튼	501
트립신-EDTA 용액 10x	시그마-알드리치	594-18씨	트립신(0.1%) EDTA(0.4%) 최종 농도
U-바닥 96 마이크로웰 플레이트	폭스바겐	734-2080

표시기 . 호 년