췌장 세포의 칼슘 역학 이미징: 췌장 섬의 세포질 칼슘 농도의 실시간 변화를 연구하는 기술

초록

출처: Hamilton, A., et. al. 마우스 췌장섬 세포의 하위 집단에서 칼슘 역학 이미징. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 췌장섬 세포의 작은 하위 집단에서 세포질 칼슘 농도의 변화를 연구하기 위해 섬 세포를 실시간으로 이미징하는 기술을 설명합니다. 소세포 하위집단은 아드레날린(adrenaline) 및 그렐린(ghrelin)과 같은 마커 화합물에 대한 기능적 반응을 사용하여 확인할 수 있으며, 이는 섬세포의 특정 집단에서 세포질 칼슘의 변화를 유도합니다. 이것은 혈당과 섬 분비 출력 사이의 교차 담화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

1. 염료를 적재하거나 센서를 표현합니다.

1. 덫 가능한 염료를 준비합니다.
   1. 포획 가능한 염료(예: Fluo-4)의 부분 표본(일반적으로 50μg)을 DMSO에 2mM의 스톡 농도로 용해합니다. 플루론산을 최종 농도 1%(DMSO의 20% 스톡 사용)에 첨가하여 염료의 용해를 개선합니다.
   2. 염료를 작은 PCR 튜브(각각 2μL)에 분취합니다. 염료는 몇 주 동안 냉동 (-20 °C)으로 보관할 수 있습니다.
2. 또는 재조합 센서를 준비합니다.
   1. 센서(예: GCaMP6f를 인코딩하는 아데노바이러스 벡터)를 10 μL 분취량으로 분배하고 -80 °C에서 보관합니다.
   2. (선택 사항) 여러 연속 희석액을 사용하여 섬(아래 참조)을 감염시켜 바이러스 스톡의 역가를 사전 테스트하여 감염에 대한 최적의 농도를 밝힙니다.
      메모: 다른 벡터(렌티바이러스, BacMam, AAV)로 인코딩된 재조합 센서에는 다른 감염 프로토콜이 필요합니다. 벡터 공급자에게 이를 확인하고 필요에 맞게 작업 비율을 최적화하십시오. 아데노바이러스의 "작동" 재고는 -20°C에서 보관할 수 있으며 여러 번 동결/해동할 수 있습니다. 과도한 동결-해동 주기는 바이러스의 유효 역가를 감소시킵니다.
3. 이미징 솔루션을 준비합니다.
   1. 이미징 용액 mM을 구성합니다 : 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7.4, NaOH 포함).
   2. 이미징 용액에 포도당(0.5M)과 만니톨(0.5M)을 비축합니다. 재고는 몇 주 동안 냉장고(4°C)에 보관할 수 있습니다.
4. 포집 가능한 염료를 로드합니다.
   1. 6mM 포도당을 함유하는 600μL의 이미징 용액에 염료 2μL를 용해시켜 염료 작업 용액을 구성합니다. 용액은 가용화를 개선하기 위해 가열되거나 와류로 처리될 수 있습니다.
   2. 염료의 작동 용액에 분리된 섬을 로드합니다. 로딩은 멀티웰 플레이트 또는 페트리 접시를 사용하여 수행할 수 있습니다. 후자의 경우, 비접착성 페트리 접시(35mm 또는 60mm) 바닥에 작업 용액의 100μL 방울을 놓고 10-30개의 섬을 방울에 피펫팅합니다.
   3. 섬 그룹이 다른 경우(예: 야생형/녹아웃) 여러 개의 유정과 여러 방울을 배치하여 동시에 적재할 수 있습니다.
   4. 염료 작업 용액에 있는 섬을 실온에서 어둠 속에서 70-90분 동안 배양합니다. 과도하게 배양하지 마십시오.
   5. 형광 현미경으로 부하를 확인하십시오. 섬은 약한 형광을 얻어야 하며, 일부 세포는 나머지 세포보다 더 밝아야 합니다. 세포의 반올림과 염료의 핵 국소화는 과부하의 징후입니다.
   6. 섬을 6mM 포도당을 함유한 무염료 이미징 용액으로 옮깁니다. 섬은 즉시 이미징에 사용할 수 있지만 선택적으로 염료를 10-15분 동안 탈에스테르화하도록 방치할 수 있습니다. 섬은 몇 시간 동안 염료를 유지하므로 여러 교대로 이미징에 사용할 수 있습니다.
5. 또는 재조합 벡터로 섬을 감염시킵니다.
   1. RPMI 배양 배지(RMPI1640(재료 표 참조)에서 작은 물방울로 플레이트를 만들고 태아 송아지 혈청 10%, 페니실린 100 units/mL, 스트렙토마이신 100 μg/mL를 보충합니다. 매체를 두 개의 60mm 플라스틱 페트리 접시 (접착제로 처리하지 않음)에 분배하고 접시를 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO₂, 절대 습도))에 보관하십시오. (예: 30 μL)를 사용하여 필요한 벡터의 부피를 최소화합니다.
   2. 약 10:⁵ 감염 단위/섬의 비율로 벡터를 추가하면 이상적으로는 감염 >2의 다양성을 얻을 수 있습니다. 이상적으로, 비율은 말초층에서 발현을 제공할 수 있는 최소 비율로 최적화되어야 합니다. 사전 적정(단계 1.2.2)이 도움이 될 수 있습니다.
   3. 20-50 개의 섬을 물방울에 도입하고 8-48 시간 동안 배양합니다. (이상적으로는 하룻밤 사이에). 섬은 세포 형태학의 변화 없이 대부분의 세포에서 희미한 녹색 형광을 나타내야 합니다.
      메모: 감염 및 발현의 성공 여부는 바이러스 용액에 노출된 시간에 달려 있습니다. 이상적으로는 바이러스가 용액에 하룻밤 동안 머물러야 하지만 15분 후에 선택적으로 제거할 수 있습니다. 그러나 감염력과 그에 따른 발현력은 현저히 낮아질 가능성이 높습니다.

2. 이미징 Ca²⁺ 다이나믹스

1. (반전된) 현미경 아래에서 섬을 고정시킵니다.
   1. 도립 현미경 검사를 위한 이미징 챔버를 조립합니다. 챔버 내부에 유리 커버슬립(두께 1 또는 1.5)을 배치하고 유리 챔버 인터페이스가 방수되는지 확인합니다. 커버슬립이 현미경 대물렌즈의 손이 닿는 범위 내에 있는지 확인합니다(부피가 큰 높은 개구수 대물렌즈의 경우 중요).
   2. 고정 액세서리를 준비합니다. 미세한 메쉬와 거친 메쉬에서 작은 직사각형(20mm x 20mm)을 자릅니다. 45-50 μm 두께의 접착 테이프를 사용하여 미세한 메쉬에 두 개의 스페이서 "벽"을 도입합니다. 이미징할 섬의 크기가 기존의 100μm를 실질적으로 초과하는 경우 스페이서의 이중층을 사용합니다.
   3. 35mm 페트리 접시를 사용하여 메쉬와 무게를 이미징 용액에 담그십시오. 플라스틱과 금속이 젖었는지 확인하십시오.
   4. 해부 현미경에서 스페이서 "벽"이 있는 미세한 메쉬를 거꾸로 뒤집고 스페이서가 위를 향하도록 합니다. 포획 가능한 염료가 로드된 여러 개의 섬을 선택하거나 P20 피펫으로 재조합 센서를 발현하고 두 스페이서 사이의 미세한 메쉬 위에 부드럽게 배치합니다. 메쉬와 와셔에 과도한 양의 이미징 용액이 포함되어 있지 않은지 확인하십시오.
   5. 워치메이커의 집게를 사용하여 섬이 있는 메쉬를 집어 올리고 이미징 챔버 내부에 거꾸로 배치하여 스페이서가 아래를 향하고 챔버 커버슬립에 직접 놓이도록 합니다. 섬이 커버슬립 중앙의 스페이서와 메쉬 사이에 갇혀 있는지 확인합니다.
   6. 챔버 내의 미세한 메쉬 위에 거친 메쉬와 무게를 배치합니다. 이미징 용액을 챔버에 도입합니다. 섬이 고정되어 있고 이미지화할 준비가 되었는지 확인합니다. 챔버의 과도한 흔들림을 피하십시오(챔버를 현미경으로 운반하고 가열된 스테이지에 삽입하는 것과 같은 작은 섭동은 허용됨).
      메모: 유사한 고정 장치가 직립 시스템에 적용될 수 있습니다.
2. 현미경을 설정합니다.
   1. 이미징 모드와 대물렌즈를 선택하고 온도 제어 스테이지에 2.1단계의 섬이 있는 챔버를 배치합니다.tage 현미경의.
      1. 온도 제어(이상적으로는 30°C에서 36°C 사이)와 관류를 설정합니다. 반전된 시스템의 경우 유입을 챔버 내 유출보다 낮게 배치하고 유출 플럭스를 유입량보다 크게 설정합니다(일반적으로 연동 펌프에서 더 넓은 내경의 튜브를 사용하여 달성됨).
      2. 유출이 용액과의 접촉면을 최소화하여 여러 개의 순차적인 작은 방울로 용액을 제거하여 긴 주기의 연속적인 용액 제거를 피하도록 합니다. 후자는 주기적 신호의 타임 랩스 이미징에서 인공물의 주요 원인으로, 이미지화 된 모든 픽셀의 규칙적인주기적 강도 진동으로 나타나고 종종 "느린 파동"으로 해석되기 때문입니다.
      3. 3mM 포도당이 포함된 이미징 용액으로 관류를 시작합니다.
   2. 녹색 형광단의 이미징을 위한 광 경로와 필터를 선택하십시오. 470에서 500 사이의 여기와 505에서 550 사이의 방출이 각각에 대해 작동합니다.
   3. 라이브 이미징을 실행하여 이미징 매개변수를 설정합니다. 관심 있는 섬을 캡처하도록 뷰를 조정합니다.
   4. 이미지의 신호 대 잡음비를 최적화합니다. 이를 위해 여기광 강도, 노출 시간 및 비닝을 조정하십시오. 설정이 가능한 최소한의 광도와 노출로 섬 내의 각 세포를 뚜렷하게 시각화할 수 있도록 합니다.
   5. 이미지 획득을 수행합니다. 작업에 따라 0.1 - 5Hz에서 이미지를 촬영할 수 있습니다. 이는 α셀 및 δ셀(>300Hz)에서 빠른 Na⁺ 구동 진동에 대한 Nyquist 기준보다 훨씬 낮으며, 이는 데이터가 기본적으로 언더샘플링됨을 의미합니다. 그러나 이러한 수요에 맞추기 위해 획득 빈도를 늘리는 것은 넓은 시야를 가진 다세포/다중 섬 이미징에서는 실현 가능하지 않습니다. GCaMP는 더 빠르게 이미징할 수 있는 반면 Fluo4는 빠른 획득 조건에서 불가피하게 표백제를 사용할 수 있습니다.
      메모: 섬 세포의 [Ca²⁺]_cyt 진동이 전기적 활동에 의해 주도된다는 점을 감안할 때, 낮은 획득 속도를 사용하는 것은 역효과를 낳을 수 있습니다. 그러나 실제로는 약 1Hz 이상의 수집 속도가 β 세포 스파이크 거동을 해결하기에 충분할 수 있는 반면, α 및 δ 세포에서 나트륨 채널 구동 진동을 감지하기 위한 임계값은 300Hz를 훨씬 상회합니다. α세포 또는 δ세포 [Ca²⁺]_cyt 진동이 1Hz 또는 0.1Hz에서 획득되는지 여부에 관계없이 심각한 언더샘플링이 이루어지며 전기적 활동보다는 셀에 의한 Ca²⁺ 처리를 반영합니다.
      1. 획득한 데이터의 품질 확인: 3mM 포도당에서 α세포 활성이 명확하게 보이거나 검출 가능해야 합니다. 이 경우 이를 확인하고 본격적인 타임랩스 이미징을 진행하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
40x/1.3 대물렌즈
GCaMP6f, (인간 유형 5) 아데노바이러스 벡터	벡터 바이오랩	1910
소 태아 세럼	시그마-알드리치	F7524-500ML
RPMI 배지	써모 피셔(Thermo Fisher, GibCo, Life Technologies)	61870044
페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔(Thermo Fisher, GibCo, Life Technologies)	15140122
Axiovert 200 현미경
플루오4	Thermo Fisher(생명 기술)	F14201

년