Primary Acinar Cell Isolation: 마우스 췌장에서 Acinar 세포를 분리하는 방법

초록

출처: Fleming Martinez, A. K., et al. 3차원 세포 배양에서 췌장 아시나르-덕트 화생 모방 및 조작. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 다양한 소화 효소를 포함하는 췌장 acinar 세포(외분비 세포)를 분리하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 1차 아시나르 세포는 췌장암 발병의 초기 사건인 아시나르-유관 화생(ADM)에 대한 생체 외 연구에 유용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 jove 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Acinar 세포 분리

1. CO ₂ 유도를 통해 마우스를 희생하고 경추 탈구를 수행합니다. 즉시 췌장을 절개하십시오. 췌장을 해부하려면 먼저 마우스의 발을 폴리스티렌 뚜껑에 고정하고 꼬리가 연구원을 향하도록 마우스의 방향을 지정한 다음 복부에 70% 에탄올을 분사합니다.
   메모: 대표 결과에 사용된 마우스는 C57BL/6 배경을 가진 12주 된 비형질전환 암컷이었습니다. 마우스 선택에 대해서는 토론 섹션에서 자세히 설명합니다.
   1. 오토클레이브 가위와 집게 세트를 사용하여 정중선에서 집게로 털/피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 요도 개구부에서 횡격막/흉곽 부위까지 털과 피부를 절개합니다.
   2. 복강이 잘 보이도록 털/피부가 잘려나도록 왼쪽과 오른쪽을 추가로 절개합니다. 그런 다음 복막 내벽(가운데 아래, 오른쪽 및 왼쪽)을 자르고 털/피부와 마찬가지로 장기에서 떼어냅니다.
   3. 집게로 장을 들어 올려 마우스의 왼쪽에 놓으면 옅은 분홍색의 췌장이 보이고 짙은 빨간색 타원형인 비장에 부착되어 있습니다. 췌장 조직은 부드럽고 스폰지 같은 질감으로 구별됩니다. 위를 따라 달리고 장과 얽히게 될 췌장을 잘라냅니다.
   4. 비장과 췌장을 분리하십시오. 그런 다음 1x 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HBSS 10mL가 들어 있는 50mL 튜브에 췌장을 넣고 이를 층류 후드로 가져옵니다.
      메모: 프로토콜의 나머지 단계는 층류 후드에서 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.
2. 췌장과 HBSS(페니실린-스트렙토마이신 포함)를 빈 계량 보트에 붓고 집게를 사용하여 췌장을 소용돌이쳐 씻습니다. 그런 다음 겸자로 췌장을 HBSS(페니실린-스트렙토마이신 포함)가 포함된 두 번째 계량 보트로 이동합니다. 다시 소용돌이치며 췌장을 씻습니다.
3. 췌장을 세 번째 HBSS(페니실린-스트렙토마이신 포함)가 포함된 계량 보트로 옮기고 췌장을 5mm 이하의 작은 조각으로 자르기 시작합니다. 다음으로, 췌장 조각과 HBSS를 빈 50mL 튜브에 붓습니다.
   1. 이렇게 하려면 계량 보트가 기울어질 때 집게를 사용하여 췌장 조각을 액체 속으로 이동합니다. 모든 조각이 더 이상 계량 보트에 부착되지 않으면 붓습니다. 집게로 남은 조각을 집어 들고 HBSS의 췌장이 들어있는 50mL 튜브에서 페니실린-스트렙토마이신으로 집게를 씻습니다.
4. 931 x g에서 4°C에서 2분 동안 원심분리기를 한 다음 5mL 피펫으로 HBSS(및 떠다니는 지방)를 제거합니다.
5. 콜라겐분해효소 5mL를 추가합니다(HBSS에서 HBSS 40mL + 5% FBS, HBSS 20mL + 30% FBS 및 2mg/mL 콜라겐분해효소 5mL를 만듭니다. 콜라겐분해효소를 여과(0.22μm 공극)로 살균하고 실온에서 보관합니다. 각 HBSS 용액을 얼음 위에 올려 췌장에 보관하십시오. 50mL 튜브를 플라스틱 파라핀 필름으로 싸서 밀봉된 뚜껑을 만든 다음 37°C에서 20분 동안 220rpm으로 흔든 인큐베이터에 넣습니다.
   메모: 콜라겐분해효소 분해 시간은 논의에서 언급한 바와 같이 달라질 수 있습니다. 배양이 끝나면 큰 조직 조각이 남아 없어야 합니다.
6. 해리를 멈추려면 췌장 함유 튜브를 얼음 위에 놓고 차가운 HBSS 5mL + 5% FBS를 추가합니다. 931 x g에서 4°C에서 2분 동안 원심분리기를 한 다음 5mL 피펫을 사용하여 상층액을 피펫으로 분리합니다.
7. 10mL의 HBSS + 5% FBS를 넣고 4°C에서 2분 동안 931 x g의 원심분리를 합니다.5mL 피펫을 사용하여 상등액을 피펫으로 분리하고 HBSS + 5% FBS 10mL로 이 단계를 반복합니다.
8. HBSS 5mL + 5% FBS에 재현탁하고 P1000을 사용하여 500μm 메시를 통해 한 번에 1mL를 50mL 튜브로 옮깁니다. P1000을 사용하여 메쉬를 통해 HBSS 5mL + 5% FBS를 추가하여 메쉬를 통해 남아 있는 췌장 세포를 세척합니다.
9. P1000을 사용하여 한 번에 1mL를 피펫팅하여 500μm 메쉬의 세포 현탁액을 105μm 메쉬를 통해 넣습니다. 다음으로, HBSS + 30% FBS가 들어 있는 튜브에 세포 현탁액을 부드럽게 피펫으로 넣습니다. 세포 현탁액 층이 상단에 형성됩니다. 원심분리하면 acinar 세포가 가라앉아 펠릿을 형성합니다.
10. 233 x g에서 4 °C에서 2분 동안 원심분리기. 상층액을 제거하고 펠릿을 1x Waymouth의 완전한 매체에 재현탁합니다.
    1. 콜라겐 또는 기저막 매트릭스에 세포를 직접 삽입하는 경우, 췌장당 7mL의 부피로 재현탁합니다. 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 감염이 진행되는 경우 췌장당 4mL를 재현탁합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
37 °C 진탕 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2, 37°C 인큐베이터	누에르	NU-5500
튜브 50ml	송골매	352070
흡수 패드, 20 "x 24"	피셔브랜드	1420662
BD 프리시전 글라이드 니들 21G x 1/2	피셔 사이언티픽	305167	해부용 핀으로 사용
비커, 600 mL	피셔브랜드	FB-101-600
원심 분리기	벡크만 쿨터	Allegra X-15R 원심분리기
콜라겐 분해 효소 유형 I, 클로스트 리듐 히스톨리티쿰	시그마	C0130-1지	멸균 분자생물학 등급의 물에 분말을 용해시켜 100mg/ml 용액을 만듭니다. 부분 표본 1개를 해동할 때 10mg/ml로 희석하고 여과 살균한 후 -20°C에서 1ml 부분 표본을 놓습니다.
덱사메타손	시그마	D1756	분말을 메탄올에 용해시키고 분취하여 -20 °C에서 보관하여 4 mg/ml 용액을 만듭니다.
에탄올, 200 proof	데콘 연구소	2701
소 태아 세럼	시그마	F0926-100mL
집게	정밀 과학 도구	11002-12
집게	정밀 과학 도구	91127-12
Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음	피셔 사이언티픽	SH3048801
얼음양동이, 직사각형	피셔 사이언티픽	07-210-103
LAB GUARD 표본 백(해부 후 마우스용)	미니그립	SBL2X69S
파라필름	베미스	미세먼지992	원고에서는 '플라스틱 파라핀 필름'이라고 불렀다.
PBS (PBS)	피셔 사이언티픽	SH30028.02
페니실린-스트렙토마이신	써모피셔 사이언티픽	15140122
피펫 팁, 10 μl	미국 과학	1110-3700
피펫 팁, 1000 μl	Olympus 플라스틱	24-165RL
피펫 팁, 200 μl	미국 과학	1111-1700
피펫 에이드	드러먼드
PIPETMAN 클래식 P10, 1-10 μl	길슨	F144802
PIPETMAN 클래식 P1000, 200-1000 μl	길슨	F123602
PIPETMAN 클래식 P20, 2-20 μl	길슨	F123600
PIPETMAN 클래식 P200, 20-200 μl	길슨	F123601
피펫, 10ml	송골매	357551
피펫, 25ml	송골매	357525
피펫, 5ml	송골매	357543
폴리프로필렌 메쉬, 105 μm	스펙트럼 랩스	146436
폴리프로필렌 메쉬, 500 μm	스펙트럼 랩스	146418
가위	정밀 과학 도구	14568-12
가위	정밀 과학 도구	14568-13
Sodium Bicarbonate (고운 백색 분말)	피셔 사이언티픽	BP328-500
수산화나트륨	피셔 사이언티픽	시즌 318-500
대두 트립신 억제제	지브코	17075029
주걱	피셔브랜드	제21-401-10
Steriflip 50ml, 0.22미크론 필터	밀리포어	SCGP00525
유형 I 쥐 꼬리 콜라겐	코 닝	354236
웨이머스 MB 752/1 미디엄 (파우더)	시그마	W1625-10X1L
무게 보트, 육각형, 중간	피셔브랜드	02-202-101