Acinar-to-ductal metaplasia induction: 3D ex vivo 배양에서 acinar cell to ductal cell differentiation을 연구하는 방법

초록

출처: Fleming Martinez, A. K. et. al. 3차원 세포 배양에서 췌장 아시나르-덕트 화생 모방 및 조작. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 생체 외 3D 배양에서 췌장 acinar 세포를 관 세포로 분화하는 기술을 설명합니다. 이는 췌장암의 조기 발병에 중요한 과정인 acinar-to-ductal metaplasia(ADM)를 조절하는 메커니즘을 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 재료, 용액 및 3차원 매트릭스 염기 준비

1. 500μm 및 105μm 폴리프로필렌 메쉬를 76mm x 76mm 정사각형으로 자릅니다. 각 사각형을 반으로 두 번 접어 더 작은 접힌 사각형을 만듭니다. 500μm 메쉬 1개와 105μm 메쉬 스퀘어 1개를 고압멸균 파우치에 넣습니다.
2. 오토클레이브 폴리프로필렌 메쉬 사각형과 두 쌍의 가위와 집게.
3. 10x Waymouth의 용액 100mL를 만듭니다. Waymouth의 분말 1 바이알 (14 g)을 탈이온(DI) 물 50 mL에 넣고 저어주고, 용해되면 7.5% (75 g/L) 중탄산나트륨 30 mL를 넣는다. DI 워터를 사용하여 최종 부피를 100mL로 가져오고 필터 멸균합니다.
   1. 10x Waymouth의 배지를 4 °C에서 보관하고 콜라겐 젤과 1x Waymouth의 배지를 준비하는 데 사용하십시오. 침전물이 형성되면 버리십시오.
4. 125 μL의 40 mg/mL 대두 트립신 억제제, 12.5 μL의 4 mg/mL 덱사메타손 및 500 μL의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하여 췌장당 1x Waymouth의 완전한 배지 50mL를 만듭니다. 여과로 살균하고 48시간 이내에 사용하십시오.
5. 콜라겐 또는 기저막 매트릭스를 사용하여 3차원 매트릭스 염기를 준비합니다(제품 정보는 재료 표 참조). 베이스를 피펫팅할 때 플레이트를 얼음 위에 놓고 기포를 피피하고 각 웰의 부피를 피펫팅한 직후 플레이트를 회전시켜 전체 적용 범위를 확보하십시오.
   1. 조직 배양 후드의 얼음에 다음 성분을 혼합하여 콜라겐 베이스를 만듭니다: 5.5mL의 I형 쥐꼬리 콜라겐, 550μL의 10x Waymouth's Media, 366.6μL의 0.34M NaOH(여과).
      참고: 이것은 하나의 24웰, 12웰 또는 6웰 플레이트에 대한 콜라겐 베이스를 만들기에 충분한 솔루션입니다. 하나의 플레이트는 하나의 췌장에서 acinar를 분리하기에 충분합니다.
   2. 콜라겐 베이스를 플레이트링하려면 80 μL(8웰 유리 슬라이드), 200 μL(24웰 플레이트), 400 μL(12웰 플레이트) 또는 800 μL(6웰 플레이트)를 사용합니다.
   3. 기저막 매트릭스 베이스의 경우 추가 구성 요소 없이 매트릭스를 피펫으로 주입합니다. 각 웰에 대해 50μL(8웰 유리 슬라이드), 120μL(24웰 플레이트), 240μL(12웰 플레이트) 또는 600μL(6웰 플레이트)를 사용합니다.
   4. 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에서 염기가 최소 30분 동안 응고된 후 이러한 염기 위에 세포가 내장된 두 번째 매트릭스 층을 생성합니다.
6. 아시나르 분리를 준비하기 위해 600mL 비커 1개, 50mL 튜브 3개, 오토클레이브 가위 1개, 오토클레이브 집게 1쌍, 얼음 양동이 1개를 계량 보트 3개와 함께 후드 아래에 보관하십시오. 그런 다음 300μL의 100x 페니실린-스트렙토마이신으로 HBSS 30mL를 만들고 두 개의 계량 보트 각각에 10mL를 넣고 최종 10mL를 50mL 튜브에 보관합니다(1.8.2 및 2.1.4 단계에서 사용).
7. HBSS에서 HBSS 40mL + 5% FBS, HBSS 20mL + 30% FBS 및 2mg/mL 콜라겐분해효소 5mL를 만듭니다. 콜라겐분해효소를 여과(0.22μm 공극)로 살균하고 실온에서 보관합니다. 각 HBSS 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
8. 실험실 벤치에서 수행할 수 있는 췌장 절제를 위한 작업 공간을 구성합니다.
   1. 호일로 덮인 폴리스티렌 뚜껑과 함께 흡수 패드를 테이블 위에 놓습니다. 그런 다음 호일 위에 4개의 핀이 있는 종이 타월을 놓습니다.
   2. 소각 백, 오토클레이브 가위 및 집게 1세트, 70% 에탄올이 함유된 스프레이 병, 얼음 양동이(1.6단계의 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HBSS 50mL 튜브 포함)와 같은 품목을 해부 작업 공간의 손이 닿는 곳에 보관하십시오.
9. 원심분리기를 4°C로, 셰이커를 37°C로 설정합니다.

2. Acinar 세포 분리

1. CO₂ 유도를 통해 마우스를 희생하고 경추 탈구를 수행합니다. 즉시 췌장을 절개하십시오. 췌장을 해부하려면 먼저 마우스의 발을 폴리스티렌 뚜껑에 고정하고 꼬리가 연구원을 향하도록 마우스의 방향을 잡고 복부에 70% 에탄올을 분사합니다.
   참고: 대표 결과에 사용된 마우스는 C57BL/6 배경을 가진 12주 된 비형질전환 암컷이었습니다. 마우스 선택에 대해서는 토론 섹션에서 자세히 설명합니다.
   1. 오토클레이브 가위와 집게 세트를 사용하여 정중선에서 집게로 털/피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 요도 개구부에서 횡격막/흉곽 부위까지 털과 피부를 절개합니다.
   2. 복강이 잘 보이도록 털/피부가 잘려나도록 왼쪽과 오른쪽을 추가로 절개합니다. 그런 다음 복막 내벽(가운데 아래, 오른쪽 및 왼쪽)을 자르고 털/피부와 마찬가지로 장기에서 떼어냅니다.
   3. 집게로 장을 들어 올려 마우스의 왼쪽에 놓으면 옅은 분홍색의 췌장이 보이고 짙은 빨간색 타원형인 비장에 부착되어 있습니다. 췌장 조직은 부드럽고 스폰지 같은 질감으로 구별됩니다. 위를 따라 달리고 장과 얽히게 될 췌장을 잘라냅니다.
   4. 비장과 췌장을 분리하십시오. 그런 다음 1x 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HBSS 10mL가 들어 있는 50mL 튜브에 췌장을 넣고 이를 층류 후드로 가져옵니다.
      메모: 프로토콜의 나머지 단계는 층류 후드에서 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.
2. 췌장과 HBSS(페니실린-스트렙토마이신 포함)를 빈 계량 보트에 붓고 집게를 사용하여 췌장을 소용돌이쳐 씻습니다. 그런 다음 겸자로 췌장을 HBSS(페니실린-스트렙토마이신 포함)가 포함된 두 번째 계량 보트로 이동합니다. 다시 소용돌이치며 췌장을 씻습니다.
3. 췌장을 세 번째 HBSS(페니실린-스트렙토마이신 포함)가 포함된 계량 보트로 옮기고 췌장을 5mm 이하의 작은 조각으로 자르기 시작합니다. 다음으로, 췌장 조각과 HBSS를 빈 50mL 튜브에 붓습니다.
   1. 이렇게 하려면 계량 보트가 기울어질 때 집게를 사용하여 췌장 조각을 액체 속으로 이동합니다. 모든 조각이 더 이상 계량 보트에 부착되지 않으면 붓습니다. 집게로 남은 조각을 집어 들고 HBSS의 췌장이 들어있는 50mL 튜브에서 페니실린-스트렙토마이신으로 집게를 씻습니다.
4. 931 x g에서 4°C에서 2분 동안 원심분리기를 한 다음 5mL 피펫으로 HBSS(및 떠다니는 지방)를 제거합니다.
5. 콜라겐분해효소 5mL(1.7단계에서 HBSS로 희석)를 췌장에 추가합니다. 50mL 튜브를 플라스틱 파라핀 필름으로 싸서 밀봉된 뚜껑을 만든 다음 37°C에서 20분 동안 220rpm으로 흔든 인큐베이터에 넣습니다.
   참고: 콜라겐분해효소 분해 시간은 논의에서 언급한 바와 같이 다를 수 있습니다. 배양이 끝나면 큰 조직 조각이 남아 없어야 합니다.
6. 해리를 멈추려면 췌장 함유 튜브를 얼음 위에 놓고 차가운 HBSS 5mL + 5% FBS를 추가합니다. 931 x g에서 4°C에서 2분 동안 원심분리기를 한 다음 5mL 피펫을 사용하여 상층액을 피펫으로 분리합니다.
7. 10mL의 HBSS + 5% FBS를 넣고 4°C에서 2분 동안 931 x g의 원심분리를 합니다.5mL 피펫을 사용하여 상등액을 피펫으로 분리하고 HBSS + 5% FBS 10mL로 이 단계를 반복합니다.
8. HBSS 5mL + 5% FBS에 재현탁하고 P1000을 사용하여 500μm 메시를 통해 한 번에 1mL를 50mL 튜브로 옮깁니다. P1000을 사용하여 메쉬를 통해 HBSS 5mL + 5% FBS를 추가하여 메쉬를 통해 남아 있는 췌장 세포를 세척합니다.
9. P1000을 사용하여 한 번에 1mL를 피펫팅하여 500μm 메쉬의 세포 현탁액을 105μm 메쉬를 통해 넣습니다. 다음으로, HBSS + 30% FBS가 들어 있는 튜브에 세포 현탁액을 부드럽게 피펫으로 넣습니다. 세포 현탁액 층이 상단에 형성됩니다. 원심분리하면 acinar 세포가 가라앉아 펠릿을 형성합니다.
10. 233 x g에서 4 °C에서 2분 동안 원심분리기. 상층액을 제거하고 펠릿을 1x Waymouth의 완전한 매체에 재현탁합니다.
    1. 콜라겐 또는 기저막 매트릭스에 세포를 직접 삽입하는 경우, 췌장당 7mL의 부피로 재현탁합니다. 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 감염이 진행되는 경우 췌장당 4mL를 재현탁합니다.

3. 바이러스 감염

1. 하나의 췌장이 두 가지 바이러스 감염(대조군 및 실험용, 예: null 및 cre)에 충분하므로 두 개의 35mm 플레이트의 뚜껑 사이에 세포 현탁액을 분할합니다. 플레이트의 뚜껑을 사용하면 현탁액에서 감염이 발생할 수 있으므로 나중에 최종 기판으로 쉽게 이동할 수 있습니다.
   1. 바이러스로 작업할 때 사용한 모든 피펫 팁을 10% 표백제에 최소 15분 동안 담그십시오.
      메모: 35mm 플레이트와 4mL 용량의 활용은 생후 8주에서 16주 사이의 비형질전환 마우스의 세포에 적합합니다. 췌장이 작거나 큰 동물에 대해 접시의 크기와 부피를 조정해야 할 수도 있습니다.
2. 아데노바이러스 감염의 경우, 각 플레이트의 뚜껑에 1:1,000 희석된 상태로 바이러스(역가 10^{7 TU}/mL 이상)를 첨가하고 소용돌이칩니다(그림 1, GFP 아데노바이러스). 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 넣고 1시간 동안 15분마다 소용돌이칩니다. 추가로 2시간 동안 배양을 계속한 다음 콜라겐 또는 기저막 매트릭스에 세포를 삽입하는 작업을 진행합니다.
3. 후드에서 바이러스 작업을 완료한 후 후드의 모든 구성 요소를 10% 표백제로 최소 15분 동안 담근 다음 70% 에탄올을 사용하여 표백제를 철저히 청소합니다.

4. 콜라겐 또는 기저막 매트릭스에 세포 내장

1. 7mL I형 쥐꼬리 콜라겐(3.3mg/mL), 700μL의 10x Waymouth 배지 및 466.6μL의 0.34M NaOH를 결합하여 얼음 위에서 콜라겐 젤을 만듭니다.
2. 콜라겐 젤과 세포 현탁액을 같은 양으로 섭취하여 부드럽게 섞습니다. 자극 또는 억제제를 추가하는 경우, 이를 콜라겐 세포 현탁액과 결합하십시오. 한 번에 하나의 웰을 플레이트합니다 (1.5.3 단계의 플레이트). 플레이트를 얼음 위에 놓고 콜라겐 세포 층을 고르게 분포시키기 위해 소용돌이칩니다.
   1. 각 웰에서 200 μL(8웰 유리 슬라이드), 500 μL(24웰 플레이트), 1000 μL(12웰 플레이트) 또는 2000 μL(6웰 플레이트) 용량의 콜라겐 세포 현탁액을 피펫팅합니다. ADM은 그림 1에서 TGF-α(50ng/mL)를 사용한 자극을 통해 유도됩니다.
3. 기저막 매트릭스에 세포를 삽입하려면 한 부분으로 된 기저막 매트릭스와 두 부분으로 구성된 세포 현탁액을 혼합합니다. 콜라겐과 마찬가지로 매트릭스 세포 현탁액과 플레이트를 얼음 위에 보관하십시오. 4.2.1에 표시된 것과 동일한 부피를 사용하여 한 번에 하나의 우물을 피펫하고 균일한 분포를 위해 소용돌이칩니다.
4. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 30분 동안 넣어 응고시킨 다음 자극제 또는 억제제와 함께 1x Waymouth의 완전한 배지를 추가합니다(그림 1은 50ng/mL에서 TGF-α 사용). 다음 날에는 미디어(자극 또는 억제제 포함)를 교체하고 이틀에 한 번씩 교체하십시오. 자극에 따라 ADM은 3일째와 5일 사이에 관찰할 수 있습니다.

결과

그림 1: TGF-α로 자극 후 콜라겐 내에 도말된 일차 아시나르 세포의 대표적인 결과.비형질전환 마우스의 1차 아시나르 세포를 GFP-아데노바이러스에 감염시키고 콜라겐 I 또는 기저막 매트릭스에 내장하고 TGF-α(50ng/mL)의 유무에 관계없이 자극했습니다. GFP 아데노바이러스에 감염된 지 24시간 후, 감염 효율성을 보여주기 위해 이미지를 캡처했습니다. 감염 후 5일이 지나면 이미지는 콜라겐 또는 기저막 기질에서 TGF-α 유무에 관계없이 자극된 세포의 차이를 나타냅니다. 덕트와 같은 구조는 흰색 화...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5% CO2, 37°C 인큐베이터	누에르	NU-5500
튜브 50ml	송골매	352070
비커, 600 mL	피셔브랜드	FB-101-600
아데노바이러스, Ad-GFP	벡터 바이오랩	1060
덱사메타손	시그마	D1756	분말을 메탄올에 용해시키고 분취하여 -20°C에서 보관하여 4mg/ml 용액을 만듭니다.
소 태아 세럼	시그마	F0926-100mL
집게	정밀 과학 도구	11002-12
유리 슬라이드, 8웰	랩텍	177402
얼음양동이, 직사각형	피셔 사이언티픽	07-210-103
마트리겔	코 닝	356234	원고에서는 '기저막 매트릭스(basement membrane matrix)'라고 불린다.
PBS (PBS)	피셔 사이언티픽	SH30028.02
페니실린-스트렙토마이신	써모피셔 사이언티픽	15140122
플레이트, 12웰	코닝 코스타	3513
플레이트, 24웰 플레이트	코닝 코스타	3524
플레이트, 6웰	송골매	353046
폴리프로필렌 메쉬, 105 μm	스펙트럼 랩스	146436
폴리프로필렌 메쉬, 500 μm	스펙트럼 랩스	146418
가위	정밀 과학 도구	14568-12
Sodium Bicarbonate (고운 백색 분말)	피셔 사이언티픽	BP328-500
수산화나트륨	피셔 사이언티픽	시즌 318-500
대두 트립신 억제제	지브코	17075029
유형 I 쥐 꼬리 콜라겐	코 닝	354236
PIPETMAN 클래식 P10, 1-10 μl	길슨	F144802
피펫, 5ml	송골매	357543
피펫 팁, 10 μl	미국 과학	1110-3700
피펫 팁, 1000 μl	Olympus 플라스틱	24-165RL
피펫 팁, 200 μl	미국 과학	1111-1700
피펫, 25ml	송골매	357525
피펫 에이드	드러먼드
피펫, 10ml	송골매	357551
PIPETMAN 클래식 P200, 20-200 μl	길슨	F123601
PIPETMAN 클래식 P1000, 200-1000 μl	길슨	F123602
PIPETMAN 클래식 P20, 2-20 μl	길슨	F123600
웨이머스 MB 752/1 미디엄 (파우더)	시그마	W1625-10X1L
무게 보트, 육각형, 중간	피셔브랜드	02-202-101

시리즈 년 년 년 년 년 년 년