동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
필요한 수술 도구는 그림 1에 나와 있고 절차의 개략도는 그림 2에 나와 있습니다.
1. 솔루션
- 증류수 900mL에 10X HBSS(재고) 100mL를 추가하여 1L HBSS(1X)를 만들어 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)을 준비합니다.
- 얼음처럼 차가운 1X HBSS 450mL에 100X 소 태아 혈청(FBS) 50mL를 첨가하여 STOP 용액을 준비합니다(신선하게 만들어야 하며 1시간 이내에 사용해야 함). 이렇게 하면 500mL STOP 용액이 됩니다. STOP 용액을 4°C로 유지하십시오.
- 얼음처럼 차가운 1X HBSS에 콜라겐 분해 효소 P 1 mg/mL를 첨가하여 콜라겐 분해 효소 P 용액(사용 후 1시간 이내에 신선하게 만들어야 함)을 준비합니다. 6 mL/마우스를 사용합니다.
- 콜라겐분해효소 P 용액에 0.05%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 추가합니다(이는 고립된 섬에 영양분을 제공합니다). 예를 들어, 6mL 콜라겐분해효소 P 용액에 3mg BSA를 사용합니다.얼음 위에 보관하십시오.
- 하나의 50 mL 튜브에 있는 모든 마우스에 필요한 콜라겐 분해 효소 P의 양을 계산하고 준비합니다.
- 야간 배양 및 배양에 사용할 5.5mM 포도당이 포함된 500mL RPMI 1640 배지에 10% FBS, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, INS-1 세포 보충제(10mM HEPES, 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨 및 0.05mM 2-메르토에탄올)를 첨가하여 완전한 RPMI 1640 배지를 준비합니다.
2. 준비
- 25mL RNase 억제 용액, 70% 에탄올 또는 증류된 H2O의 50mL 튜브 3개를 채웁니다. 이러한 솔루션은 시술 전과 시술 중에 수술 도구를 청소하는 데 사용됩니다.
- 프로토콜을 시작하기 전에 RNase 억제 용액에 도구의 팁을 30분 동안 담그십시오. 이렇게 하면 도구에서 잠재적인 RNase가 제거됩니다.
- 수술 중에 사용할 수 있도록 6인치 x 6인치 크기로 미리 절단된 흡수 패드.
- 1X HBSS 용액을 미리 준비하고 4°C에서 보관하십시오. 수술 전에 STOP 용액을 준비하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
- 수술 직전에 콜라겐분해효소 P 용액을 준비하고 얼음에 보관하십시오.
메모: 이것은 준비 후 2시간 이내에 사용해야 합니다.
- 분해 및 정제를 위해 50mL 튜브에 라벨을 부착하고, 각 마우스에 대해 2개의 튜브를 준비하며, 하나는 분해용이고 다른 하나는 섬 정제용입니다. 동물 ID가 두 튜브에 모두 있는지 확인하십시오.
- 첫 번째 50mL 튜브에 콜라겐분해효소 P 용액 3mL를 추가합니다. 나머지 3mL의 콜라겐 분해 효소 P를 주입합니다.
- 나머지 3mL의 콜라겐분해효소 용액을 30G 1/2인치 바늘이 장착된 3mL 주사기에 넣습니다. 얼음 위에 주사기를 놓습니다.
3. 절차
- RNase 억제 용액에서 모든 도구를 제거한 다음 먼저 70 % 에탄올이 함유 된 튜브에 담근 다음 증류 된 H2O가 들어있는 튜브에 담근 다음 깨끗한 종이 타월로 자연 건조합니다.
- 마우스가 완전히 마취될 때까지 0.5mL의 이소플루란이 들어 있는 챔버에 마우스를 넣습니다.
- 챔버에서 마우스를 제거하고 집게로 발 패드를 꼬집어 마취 상태를 확인합니다. 심부 마취는 호흡이 꾸준히 느려지고 마우스가 발을 꼬집는 것에 반응하지 않는다는 관찰을 기반으로 합니다. 마우스가 깊은 마취 상태임을 확인한 후 경추 탈구가 있는 마우스를 안락사시킨 다음 흡수 패드에 마우스를 놓습니다.
- 마취된 마우스를 엎드려 놓고 목에 압력을 가하고 꼬리를 당겨 척추를 뇌에서 탈구시킵니다.
- 누운 자세로 있는 마우스의 팔다리를 흡수 패드에 테이프로 붙이고 몸에 70% 에탄올을 분사하고 과도한 에탄올을 닦아냅니다.
- 커버 유리 집게와 구부러진 수술용 가위를 사용하여 절개합니다. 먼저 복부 부위 (~ 3cm)의 피부를 수평으로 절개하고 피부를 활짝 당겨 복벽을 노출시킵니다. 그런 다음 복막을 수직으로 절개(~3–4cm)하여 복강 내 췌장을 완전히 노출시킵니다(그림 3).
- 담관을 노출시키기 위해 간의 엽을 우월하게 밀면 담관이 옅은 분홍색 튜브로 나타납니다(그림 3).
- 복강의 오른쪽 요추/장골 부위에서 오른쪽으로 장을 조심스럽게 움직여 담관과 간동맥을 노출시킵니다(그림 3).
- Schwartz micro serrefines(그림 1)를 사용하여 총담관을 가능한 한 간에 가깝게 조심스럽게 고정합니다.
- 췌관(pancreatic duct)과 총담관(common bile duct)의 결합에 의해 형성된 십이지장 유두(duodenal papilla)에 위치한 Vater의 앰풀라(ampulla)를 확인합니다. Vater의 앰풀라(ampulla)는 총담관의 진입점인 해부 현미경으로 볼 때 부풀어 오른 것처럼 보입니다(그림 4).
메모: 해부 현미경의 광도/각도를 조정하면 더 쉽게 찾을 수 있습니다.
- 콜라겐 분해 효소 P 용액 3mL가 든 주사기를 Vater의 앰풀라에 삽입합니다. 그림 5와 같이 바늘을 총담관 길이의 약 1/4 정도(팽대가 담관으로 연결됨) 동안 관에 밀어 넣습니다.
- 바늘이 앰풀라에 들어가면 바늘의 방향이 관과 평행이 되도록 합니다.
- 바늘이 덕트에 구멍을 뚫는 것을 방지하기 위해 마이크로 Adson 집게로 고정하여 바늘을 고정합니다(그림 5).
- 그림 6과 같이 주사기에서 콜라겐분해효소 P 용액 3mL를 총담관(저항을 느낄 수 있을 정도)으로 천천히 꾸준히 주입합니다. 목표는 콜라겐분해효소가 췌관으로 들어가도록 역류 압력을 생성하는 것입니다. 췌장의 머리, 목, 몸통 및 꼬리 부분이 모두 완전히 팽창된 경우 주사가 성공적인 것으로 간주됩니다.
메모: 췌장이 완전히 팽창하지 않았거나 비장 영역이 완전히 팽창되지 않은 경우 섬 수율이 낮습니다. 비장 지역은 가장 많은 수의 섬을 포함하고 있습니다6. 인플레이션은 용액으로 채워진 췌장 조직 사이의 열린 공간이 나타나는 것으로 확인할 수 있습니다.
- 팽창된 췌장을 조심스럽게 해부하고 50mL의 얼음처럼 차가운 콜라겐분해효소 P 용액이 들어 있는 3mL 소화 튜브에 넣습니다.
- 2개의 집게를 사용하여 췌장을 제거합니다(곡선 및 Micro Adson; 그림 1 참조): (비장에서 시작하여 췌장을 비장에서 당겨 빼내고 위와 십이지장을 따라 계속 제거합니다.
메모: 절개가 필요하지 않습니다.
- 미세한 수술용 가위를 사용하여 3mL의 얼음처럼 차가운 콜라겐분해효소 P 용액으로 소화관에서 췌장을 3-5초 동안 자릅니다(그림 7A).
- 튜브를 37°C 수조의 랙에 고정하고 100–120rpm으로 약 12-13분 동안 흔듭니다.
- 배양 후 콜라겐분해효소 P 소화액이 균질해질 때까지 손으로 튜브를 부드럽게 흔들어 조직을 파괴합니다(그림 7B). 균질성은 췌장의 미세한 입자가 모래와 같은 모양으로 확인됩니다. 일반적으로 약 30초 정도의 부드러운 악수이면 충분합니다. 튜브를 빛이 있는 곳으로 들어 조직이 잘 균질화되어 있는지 검사합니다. 필요한 경우 ~15초 동안 더 흔듭니다.
- 분해되면 즉시 튜브를 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 STOP 용액 40mL를 추가하여 효소 분해를 종료합니다.
메모: 이 시점에서 소화관은 여러 마우스에서 작업하는 경우 최대 2시간까지 얼음 위에 둘 수 있습니다.
- 스윙 버킷 원심분리기에서 튜브를 300 x g에서 30초 동안 원심분리(원심분리기 온도는 유연함).
메모: 스윙 버킷 원심 분리기를 사용하여 조직 펠릿이 튜브 벽이 아닌 50mL 튜브의 바닥에 형성되도록 합니다. 이것은 더 나은 섬 수율을 위해 중요합니다.
- STOP 용액으로 원심분리를 디캔팅하고 2회 더 반복하여 각 스핀 후에 용액을 디캔팅합니다. 이후 세척할 때마다 20mL의 STOP 용액을 사용하십시오.
- 매번 돌리기 전에 50mL STOP 용액에 50mL 튜브의 조직 펠릿을 부드럽게 흔들어 펠릿을 방해합니다.
- 조직 펠릿을 얼음처럼 차가운 HBSS 40mL로 다시 현탁시키고 300 x g에서 30초 동안 원심분리합니다.
- HBSS 용액이 있는 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 원심분리를 디캔팅하고 두 번 더 반복하고 각 회전 후 용액을 디캔팅합니다. 세탁할 때마다 HBSS 20mL를 사용하십시오.
- 매번 회전하기 전에 펠릿을 파괴하여 20mL HBSS 용액이 들어 있는 튜브를 부드럽게 흔들어 튜브 바닥에서 펠릿을 분리합니다.
- 마지막 원심분리 후 모든 HBSS를 제거합니다.
- 그런 다음 펠릿이 들어 있는 50mL 튜브에 5mL의 실온 밀도 구배를 추가합니다. 소용돌이는 균질화될 때까지 저속으로 잠시 동안 진행됩니다.
- 5mL 튜브에 실온 밀도 구배를 50mL 더 추가합니다.와류/혼합하지 마십시오.
메모: 중단 없이 더 나은 그래디언트가 형성될 수 있도록 꾸준하고 가만히 유지하는 것이 중요합니다.
- 실온 HBSS 완충액 10mL를 튜브(밀도 구배 포함)에 피펫으로 넣고 천천히 한 방울씩 천천히 투입하여 구배가 형성되도록 합니다. 10mL 피펫이 있는 피펫 건을 사용하여 HBSS를 적가합니다.
- 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 1700 x g에서 15분 동안 튜브를 회전시킵니다. 기울기를 유지하려면 가속/감속 속도를 가장 낮은 설정으로 변경해야 합니다(그림 7C).
- 탈수 후 그라데이션을 방해하지 않고 튜브를 조심스럽게 제거하십시오. 차가운 HBSS(피펫 HBSS 위아래)로 미리 적신 피펫 건을 사용하여 밀도 구배와 HBSS 사이에 형성된 섬 층(5–10mL)을 새로운 50mL 섬 수집 튜브로 피펫으로 빼냅니다.
메모: 섬을 피펫팅하기 전에 차가운 HBSS로 파이펫을 적셔 섬이 파이펫의 내벽에 달라붙는 것을 방지하는 것이 도움이 됩니다.
- 분리가 완료되지 않은 경우, 밀도 구배층에서 섬이 보이고, 계면에 형성된 섬층과 함께 밀도 구배(맨 아래 층)의 전체 10mL를 피펫으로 빼냅니다(HBSS 최상층의 약 8–10mL만 남김).
메모: 섬 층과 밀도 구배 층(맨 아래 층)을 모두 수집하면 잔해를 수집하여 섬 채취 시간을 연장할 수 있지만 다른 단계는 변경되지 않습니다. 이 두 층을 모두 수집하는 것은 섬 층이 잘 형성되어 있을 때 필요하지 않습니다.
- 섬이 들어 있는 새로운 50mL 튜브에 얼음처럼 차가운 HBSS 20mL를 추가한 다음 스윙 버킷 원심분리기에서 350 x g으로 3분 동안 원심분리합니다.
- 스핀 후, 바닥에 섬이 들어있는 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 피펫(기울어뜨리지 마십시오)합니다(바닥에 ~3mL 남겨두기). 상등액을 버리십시오.
- 세척과 원심분리를 최소 3회 반복합니다. 매번 20mL의 HBSS를 추가하고 각 탈수 전에 펠릿을 현탁하십시오.
- RPMI-1640 complete media bottle을 사용하기 전에 37°C의 수조에서 데우십시오. 마지막 원심분리 후 HBSS를 모두 제거하고 이전에 준비한 완전한 RPMI-1640 배지 4mL(FBS, INS-1 세포 보충제 및 페니실린/스트렙토마이신 포함)를 펠릿에 추가합니다.
- 튜브를 부드럽게 휘젓아 펠릿을 제거하고 즉시 RPMI-1640 매체를 100mm 페트리 접시에 붓습니다. 튜브에 RPMI-1640 매체 5mL를 더 추가하고 부드럽게 휘둘러 남아 있는 섬을 씻어낸 다음 매체를 동일한 페트리 접시에 붓습니다.
- 해부 현미경으로 20μL 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 건강한 섬을 선택하고 10mL의 완전한 RPMI 1640 배지가 들어 있는 새 페트리 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 볼 때, 섬은 상대적으로 투명하고 희미한 외분비 조직에 비해 표면이 매끄럽고 구형/직사각형 및 황금빛 갈색으로 보여야 합니다.
메모: 해부 현미경의 배율은 일반적으로 12.5–16x로 설정됩니다. 섬 수율은 쥐의 품종, 나이 및 성별을 포함한 다양한 요인에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 일반적으로 생후 4-10개월 된 건강한 C57BL/6J 마우스에서 250-350개의 건강한 섬을 산출합니다.
- 다음날 실험을 위해 밤새 5% CO2 주입 및 95% 가습 공기로 37°C의 멸균 인큐베이터에서 섬을 배양하거나 나중에 원하는 분석을 위해 섬을 동결합니다.
- 섬이 동결되면 분비 분석에 사용할 수 없으며 RNA 또는 단백질 정량화에만 사용할 수 있습니다. 동결할 세포를 수집하려면 HBSS 완충액에 넣고, 200–500 μL의 완충액에서 모든 섬을 수집하고, 1.5 mL 튜브로 옮기고, 1-2분 동안 350 x g를 원심분리하고, 30-40 μL 이하의 용액을 남기고 상등액을 제거하고, 단기 보관(며칠)의 경우 -20 °C, 장기 보관의 경우 -80 °C에 둡니다.
