스페로이드의 면역형광 염색: 세포 내 및 세포 외 항원 발현을 위한 스페로이드를 분석하는 기술

초록

출처: Cavaco, A. C. M. et al. 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입 체외 연구를 위한 보다 생리학적 시스템으로서의 3D 스페로이드 모델. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 섬유아세포 또는 CAF의 분화를 이해하기 위해 스페로이드의 면역형광 염색 기법을 설명합니다. 이 프로토콜은 스페로이드 내 ECM 단백질의 침착을 포함하여 세포 내 및 세포 외 항원의 발현을 감지하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 스페로이드의 면역형광 염색

1. 약 24시간 후에 실험 조건별 또는 분석할 단백질당 하나의 1.5mL 반응 튜브에 스페로이드를 수집합니다. 예를 들어, TGF-β1로 자극된 iNF의 스페로이드를 처리되지 않은 대조군 iNF와 다른 튜브에 넣습니다. 너무 강한 전단력으로 인한 스페로이드의 파열을 방지하려면 피펫 팁의 끝을 잘라 오리피스를 확대합니다. 하나의 반응 튜브에 최소 5-10개의 스페로이드를 포함하여 복제를 허용하고 세척 단계 중 가능한 손실을 고려합니다.
2. 벤치탑 원심분리기로 스페로이드를 1,000 x g에서 약 30-60초 동안 원심분리합니다. 펠릿화된 스페로이드를 방해하지 않고 피펫팅으로 메틸셀룰로오스 함유 상등액을 조심스럽게 제거합니다.
3. 50μL의 1x PBS로 세척합니다. 원심분리 단계를 반복하고 1.2에 설명된 대로 피펫팅으로 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
4. 염색할 단백질에 따라 PBS에 50μL의 4% 파라포름알데히드로 실온에서 20분 동안(αSMA, NG2 및 인테그린 α3β1의 경우) 또는 -20°C에서 10분 동안 50μL의 메탄올(라미닌-332 서브유닛의 경우)로 고정합니다.
5. 1.2-1.3단계에서 설명한 대로 세탁 단계를 반복합니다.
6. PBS에 0.1% Triton-X를 넣어 실온에서 4분 동안 세포를 투과시킵니다.
7. 1.2-1.3단계에서 설명한 대로 세탁 단계를 세 번 반복합니다.
8. 5% FBS 및 2% BSA를 함유한 PBS에서 스페로이드를 RT에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 단백질 상호 작용 부위를 차단합니다.
9. PBS의 1차 항체 30μL, 2.5% FBS 및 1% BSA의 스페로이드를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음과 같은 1차 항체가 사용되었습니다: 5μg/mL에서 항-αSMA Cy-3 접합 및 항-NG2; BM2 안티 라미닌 α3, 6F12 안티 라미닌 β3 및 안티 라미닌 γ2 20 μg/mL.
10. 1.2-1.3단계에서 설명한 대로 세탁 단계를 세 번 반복합니다.
11. PBS의 2차 항체 30μL, 2.5% FBS 및 1% BSA의 2차 항체와 함께 스페로이드를 90분 동안 RT에서 배양합니다. 사용된 2차 항체는 Alexa 488 항토끼 및 항마우스(5μg/mL)입니다.
12. 1.2-1.3단계에서 설명한 대로 세탁 단계를 세 번 반복합니다.
13. 실온에서 4분 동안 30μL의 DAPI 염색 용액으로 세포를 배양합니다.
14. 1.2-1.3단계에서 설명한 대로 세탁 단계를 반복합니다.
15. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS 한 방울의 유리 슬라이드에 스페로이드를 놓습니다.
16. 10배 배율을 사용하여 레이저 스캐닝 현미경에서 형광 현미경으로 스페로이드를 이미지화합니다. z-스택의 서로 다른 광학 평면(15-20개의 스택 평면)에서 스페로이드의 다른 광학 단면을 취합니다. 현미경에서 레이저 설정을 지정하려면 관심 항원에 대해 음성 세포로 구성된 스페로이드 또는 2차 항체로만 염색된 스페로이드를 사용합니다. 비교할 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 재사용합니다.
17. 이전에 발표된 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 현미경 이미지를 분석합니다. 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다. 배경으로, cell-free 관심 영역(ROI)의 통합 신호 밀도를 결정합니다. 총 보정된 세포 형광(TCCF)을 다음과 같이 계산합니다
    TCCF = Integrated signal density - (선택한 스페로이드 면적 x 배경의 평균 형광)
18. 스페로이드의 총 보정 형광(TCF)을 스페로이드 면적과 스택 수로 정규화된 TCCF로 측정합니다.
    TCF = 스페로이드의 TCCF / (스페로이드 면적 x 스택 수)

결과

그림 1. ImageJ를 사용하여 스페로이드에서 관심 단백질의 면역형광 염색을 정량화하기 위한 순차적 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드(DAPI)	시그마-알드리치	D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit 마우스 (단클론)			만든
알부민 분획 V - BSA	애플리켐	대답1391
Alexa fluor 488 염소(다클론) 안티 마우스	인비트로젠	A11029 (영문
Alexa fluor 488 염소(다클론) 토끼	인비트로젠	A11034
안티 라미닌 γ2 서브유닛 마우스(단클론)	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-28330
벤치 원심분리기	피셔 사이언티픽	50-589-620	새싹
BM2 안티 라미닌 α3 서브 유닛 마우스(단클론)			Patricia Rousselle 교수(CNRS, Lyon)가 친절하게 제공합니다.
원심분리기 튜브 50 mL	코 닝	제430290
컨포칼 현미경	자이스
DMEM(고포도당 4.5g/L)	론자	BE12-604F
인간 1차 췌장 섬유아세포(primary pancreatic fibroblasts)	펠로비아이오텍	PB-H-6201
페니실린/스트렙토마이신	지브코	15140-122
현미경 슬라이드	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	J1800AMNZ
파라포름알데히드	리델-드 하엔	16005
트리톤X-100	시그마-알드리치	X100RS