동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 jove 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. SQ 종양의 IRE
- 구형파 electroporator, 안전 풋 스위치, 전극(바늘 배열 대 핀셋 트레드) 및 어댑터와 같은 필요한 재료를 준비합니다. 멸균 봉합사(비흡수성 4-0), 알코올 면봉, 이발기, 제모 크림, 눈 윤활제, 면 거즈, 부프레노르핀 및 마취제도 근처에 두십시오.
- 가스 멸균을 사용하여 핀셋 또는 바늘 배열 전극을 멸균합니다. 오토클레이빙은 권장되지 않습니다. 유리 구슬 살균기를 사용하여 동물 사이의 전극을 살균합니다.
- SQ 종양 임플란트가 직경이 5mm에 도달하면 마우스에서 마취를 성공적으로 유도하기 위한 단계를 따르십시오. 간략히, 수술 30분 전에 수혜자 마우스에게 0.05 - 1mg/kg 부프레노르핀 진통제 SQ를 투여합니다. 그런 다음 정밀 기화기(또는 기타 마취제)를 사용하여 산소(2 L/분) 중 2 - 3% 이소플루란으로 수용 마우스를 마취합니다. 전체 절차 동안 마우스를 37°C 가열 패드에 보관하십시오. 건조를 방지하기 위해 눈에 윤활제를 바르십시오. 초기에는 놀라운 반사 작용이 없어 마취의 깊이를 검사하고, 부드러운 발가락 꼬집음에 대한 페달 반사 부족으로 수술 평면 마취를 확인합니다. 전체 수술 과정에서 마취를 유지하십시오.
- 마취된 마우스를 옆으로 눕혀 옆구리의 SQ 종양에 접근합니다. 이발기를 사용하여 머리카락을 제거하고 알코올 면봉을 사용하여 피부를 청소합니다.
- SQ 종양의 경우 2개의 바늘 배열 전극을 사용합니다. 겸자를 사용하여 종양 부위 바로 아래의 피부를 들어 올리고 몸과 평행한 피부를 통해 전극을 삽입하여 복막강을 관통하지 않도록 합니다. 일단 피부를 통과하면 종양을 감싸는 방식으로 전극을 배치합니다.
- 총 150개의 펄스에 대해 1,500V/cm에서 1Hz의 주파수에서 100μs 펄스를 전달하도록 electroporator를 프로그래밍합니다. 풋 페달을 사용하여 펄스를 전달합니다. 열 발산을 허용하고 전극의 올바른 위치를 확인하기 위해 각 10개 펄스 세트를 10초로 분리합니다.
메모: 마비제를 사용하지 않으면 마우스는 IRE로 인한 근육 수축을 경험하게 되며, 수동으로 고정하지 않으면 전극의 변위를 유발할 수 있습니다.
- 200초를 초과해서는 안 되는 완전한 투여 후 전극을 제거하십시오. 전기천공기에 표시되는 실제 전압을 기록하십시오. 생쥐가 IRE를 따라 집 케이지에서 회복하고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다. 회복을 용이하게 하기 위해 케이지를 가열 패드에 놓습니다. 회복 과정에서 호흡, 관류 등과 같은 활력 징후를 모니터링합니다. 마우스가 회복되면 바로잡기 반사의 징후를 확인한 다음 케이지 캔을 일반 하우징으로 되돌립니다. 수술 후 8 - 12시간 후에 부프레노르핀 0.05 - 0.1 mg/kg을 투여하고, 통증 징후가 있을 경우 수술 후 8 - 12시간마다 투여합니다.
2. 정소성 종양의 IRE
참고: 정형소성 종양의 IRE는 동일한 마우스에 대한 두 번째 생존 수술을 포함하므로 시작하기 전에 현지 IACUC의 특별 승인이 필요합니다.
- 필요한 재료 준비: 가위, 메스, 바늘 드라이버, 뾰족한 집게 및 평평한 집게와 같은 수술 도구를 고압멸균합니다. 멸균 봉합사(흡수성 6-0 및 비흡수성 4-0), 알코올 면봉, 이발기, 제모 크림, 눈 윤활제, 면봉, 10% 포비돈 요오드 용액, 수술용 드레이프, 발열 패드, 구형파 전기천공기, 안전 발 스위치, 전극 및 어댑터, 부프레노르핀 및 마취제.
- in vivo bioluminescence imaging을 통해 마우스의 정소성 종양 성장을 평가합니다. 정소성 이식 후 4일째부터 이미징을 통해 종양 성장을 추적하고 일주일에 두 번 이미징을 수행합니다. 이미징 당일, 이미징 10분 전에 마취된(산소 내 2 - 3% 이소플루란(2 L/분)) 투여된 마우스에게 30mg/kg D-루시페린을 투여합니다(복강 내 주사). 발광 필터 없이 발광 설정을 사용하여 자동 형광이 없는 가열 스테이지가 있는 발광 이미저에서 최소 5초 노출을 위해 마우스의 마취를 유지하면서 발광 효과를 나타내는 이미지.
메모: 정소성 종양은 이식 후 8-10일 동안 종양이 명확하게 보이고 Luciferase 발광 이미지에서 볼 수 있듯이 여전히 췌장에 국한되어 있을 때 IRE 치료에 이상적입니다
- 단계에 따라 이식된 종양을 찾습니다. 간략하게, 수술 30분 전에 수혜자 마우스에게 0.05 - 1mg/kg 부프레노르핀 진통제 SQ를 투여합니다. 정밀 기화기(또는 기타 마취제)를 사용하여 산소(2 L/min) 중 2 - 3% 이소플루란으로 수용 마우스를 마취합니다. 전체 절차 동안 마우스를 37°C 가열 패드에 보관하십시오. 건조를 방지하기 위해 눈에 윤활제를 바르십시오. 초기에는 놀라운 반사 작용이 없어 마취의 깊이를 검사하고, 부드러운 발가락 꼬집음에 대한 페달 반사 부족으로 수술 평면 마취를 확인합니다. 전체 수술 과정에서 마취를 유지하십시오. 마우스를 등에 대고 복부의 왼쪽이 노출되도록 오른쪽으로 부드럽게 돌립니다. 제모 크림을 사용하여 마우스의 복근을 제거하고 절개 후 복부에 머리카락이 들어가지 않도록 거즈로 청소합니다. 10% 포비돈 요오드를 3회 사용한 후 알코올 물티슈를 사용하여 수술을 위해 왼쪽 복부를 준비합니다. 멸균 메스를 사용하여 피부를 가로 또는 비스듬히 1.5cm, 정중선 왼쪽으로 1cm, 흉곽 아래, 비장 약간 내측으로 절개합니다. 그런 다음 복부 근육 조직을 통해 절개 부위를 확장하여 위에 있는 표재성 절개를 반영합니다. 끝이 평평한 집게를 사용하여 비장을 찾고 복강에서 부드럽게 외부화합니다. 멸균 면 어플리케이터를 사용하여 비장을 수축시키고 비장 바닥에 붙어있는 췌장의 꼬리를 찾습니다. 끝이 평평한 집게를 사용하여 췌장의 꼬리를 옆으로 집어넣습니다. 종양을 찾기가 쉽지 않은 경우 뭉툭한 코 집게를 사용하여 위와 비장을 부드럽게 움직여 종양을 식별합니다.
- 뭉툭한 코집게로 종양을 외부화하고 핀셋의 백금 전극으로 종양을 단단히 포획합니다. 구형파 electroporator를 사용하여 1.7단계에서 프로그래밍된 대로 electroporation pulses를 foot switch로 제어되는 10개의 펄스 세트로 전달합니다.
- 출혈 징후가 있는지 모니터링하기 위해 IRE 후 최소 60초 동안 종양을 외부로 유지하십시오. 종양을 복강에 다시 삽입하고 설명된 대로 절개 부위를 닫습니다. 간단히 말해서, 연속 또는 중단 스티치로 6-0 흡수성 봉합사를 사용하여 복부 근육 조직을 닫고 3-0에서 6-0 비흡수성 중단 봉합사를 사용하여 그 위에 있는 피부를 닫습니다. 이 시점에서 마취를 중단하십시오. 1.7에 설명된 대로 마우스가 복구되도록 합니다. 복구될 때까지 마우스를 모니터링합니다.
- 2.2단계에 따라 in vivo luciferase imaging을 사용하여 종양 성장에 대한 IRE의 효과를 모니터링합니다.
