자기 바이오프린팅 3D 스페로이드 공동 배양: 암세포와 섬유아세포를 공동 배양하는 방법

초록

출처: Noel P. et al.췌장암 세포 및 섬유아세포의 3차원 스페로이드 공동 배양의 준비 및 대사 분석. J. Vis. 특급 (2017년)

이 동영상은 공동 배양된 췌장암 세포와 섬유아세포의 3D 자기 바이오프린팅에 대해 설명합니다. 췌장암 세포와 활성화된 췌장 섬유아세포 세포는 자기력의 영향으로 스페로이드를 생성하기 위해 생체 적합성 나노 입자 어셈블리를 사용하여 공동 배양 및 자화됩니다.

프로토콜

1.마그네틱 바이오프린팅을 이용한 췌장암 3D 스페로이드 배양

1. 표준 무균 조직 배양 기술을 사용하여 T75 플라스크에서 관심 세포를 적절한 성장 배지에서 70-80%의 포화도로 배양합니다.
   메모: 일반적으로 70-80% confluent T75 플라스크에서 5-7 × 10⁶ 세포를 수확했습니다. 이 연구에서는 Patu8902(췌장 종양 세포)와 PS1 세포(활성화된 췌장 성상 세포)의 두 가지 세포 유형이 사용되었습니다. 두 세포주를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS), 1× 페니실린-스트렙토마이신(p/s)이 보충된 Roswell Park Memorial Institute 배지 1640(RPMI-1640)에서 배양했습니다.
2. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL로 세포를 한 번 세척합니다.
3. 37°C에서 5-10분 동안 0.05% 트립신-EDTA 2mL로 트립신화하여 플라스틱 표면에서 세포를 분리합니다.현미경으로 세포 분리를 확인합니다.
4. 분리된 세포에 8mL 성장 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다. 과도한 트립신화는 세포의 건강/생존력에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 피하십시오.
5. 피펫 세포를 위아래로 움직여 단일 세포 현탁액을 생성하고 자동화된 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하여 세포 밀도를 계산합니다.
6. 그 동안 NS 바이알을 주변 온도로 평형을 이룹니다.
7. 원하는 수의 스페로이드(웰)를 파종하고 새로운 15mL 코니컬 튜브로 분취하는 데 필요한 세포의 양을 계산합니다. 예를 들어, 웰당 5,000개의 세포가 있는 전체 96웰 플레이트를 시딩하려면 최소 5.5개 × 10개의⁵개 세포를 분취합니다.
8. 500 x g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상층액을 조심스럽게 asp 화시키거나 디캔팅하고 성장 배지에서 1.0 x 10⁶ cells/mL의 농도로 세포를 재현탁합니다. 전단을 피하기 위해 구멍이 넓은 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 피펫을 만듭니다. 예를 들어, 550 μl의 성장 배지에 5.5 x 10⁵ 세포를 재현탁합니다.
9. 평형을 이룬 NS를 사용하여 원하는 양의 셀을 자화합니다(1.6단계).
   1. 성장 배지의 세포 현탁액에 NS를 직접 첨가하고 부드럽게 교반합니다. 세포의 효율적인 자기 라벨링을 위해 100μL 세포당 10μL NS를 사용합니다(1 x 10⁶ cells/mL에서 재현탁).
      메모: 일반적인 실험의 경우 550μL의 5.5×10⁵ Patu8902 세포를 55μL NS로, 1100μL의 1.1×10⁶ PS1 세포를 110μL NS로 별도로) 라벨링합니다.
   2. 세포 현탁을 보장하기 위해 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집습니다. 일시적으로 cell-NS 혼합물을 24웰 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 자화될 각 셀 유형에 대해 이 작업을 개별적으로 수행합니다. NS가 세포 표면에 결합할 수 있도록 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 플레이트를 덮고 세포를 배양합니다.
      메모: Patu8902 또는 PS1 단독 세포에서 시작하는 스페로이드의 배양 및 분석과 자기 드라이브에 인쇄하기 전에 미리 혼합된 두 세포 유형으로 시작하는 공동 배양 스페로이드는 독립적인 실험에서 이 방법을 사용하여 성공적으로 달성되었습니다. Patu8902 및 PS2 세포에서 공동 배양 스페로이드를 생성하는 방법은 다음 단계에서 설명합니다.
10. 피펫은 자화된 세포를 부드럽게 위아래로 움직여 고르게 혼합하고 원하는 세포 수를 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 스페로이드 파종의 경우 총 15,000개의 세포(5,000 Patu8902 + 10,000 PS1)를 사용하고 96웰 플레이트의 웰당 총 부피 150μL로 조정합니다.
    메모: 각 웰에 분배되는 최종 부피는 사용된 셀의 수에 관계없이 동일해야 합니다.
11. 96웰 마그네틱 스페로이드 드라이브 위에 세포 기피성 96웰 플레이트를 놓고 각 웰에 150μL의 세포 혼합물을 분배합니다. 세포가 자석 위의 우물 중앙으로 천천히 모이는 것을 관찰하십시오. 마그네틱 스페로이드 드라이브가 부착된 상태에서 37°C로 설정된 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 플레이트를 덮고 배양합니다. 마그네틱 드라이브를 제거하고 최대 7일 동안 추가 성장을 위해 배양합니다.
    메모: 자기 스페로이드 드라이브를 사용하여 스페로이드 프린팅을 위해 세포 발수 성장판을 사용하는 것이 중요합니다. 홀딩 드라이브가 아닌 더 얇은 작은 자석이 있는 스페로이드 드라이브를 사용하는지 확인하십시오.
12. 매일 스페로이드의 성장을 모니터링하십시오. 마그네틱 홀딩 드라이브에 장착된 성장 플레이트를 비스듬히 놓고 멀티채널 피펫을 사용하여 사용한 배지를 뽑아내어 3일마다 새로운 성장 배지를 보충합니다.
    메모: 15,000개 세포/웰에서 공동 파종된 Patu8902 및 PS1 세포는 5-7일 이내에 직경 400-600μm의 3D 스페로이드로 성장합니다. 이 시점에서 스페로이드는 대사 특성화, 약물 평가 및 기타 다운스트림 응용 분야에 사용할 준비가 되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신 EDTA	시그마	제25300-054
96웰 세포 발피제 플레이트	USA 사이언티픽/그리너 바이오 원	655970	스페로이드 성장판
Cellometry 세포 계수 슬라이드	넥셀롬	CHT4-SD100-002
n3D 마그네틱 스페로이드 드라이브	나노3D 생명과학	655841	스페로이드 바이오프린팅 키트의 일부
n3D 마그네틱 스페로이드 홀딩 드라이브	나노3D 생명과학	655841	스페로이드 바이오프린팅 키트의 일부
n3D 나노셔틀-PL	나노3D 생명과학	655841	스페로이드 바이오프린팅 키트의 일부: 4 °C에서 보관
Patu8902 셀	실험실 재고		췌관 선암종 셀
PS1 세포	실험실 재고		활성화된 췌장 성상 세포
RPMI1640	지브코	11875-093	세포용 성장 배지, 스페로이드