3D 스페로이드의 세포외 플럭스 분석: 췌장 종양 스페로이드의 대사 활성을 측정하는 방법

초록

출처: Noel, P., et al. 췌장암 세포 및 섬유아세포의 3차원 스페로이드 공동 배양의 준비 및 대사 분석. J. Vis. 특급 (2017).

이 프로토콜은 췌장암 세포(Patu8902)와 활성화된 췌장 섬유아세포(PS1)의 공동 배양에서 생성된 3D 스페로이드에 대해 세포 외 플럭스 분석을 수행하여 두 가지 주요 에너지 생성 경로인 해당작용과 미토콘드리아 호흡을 측정하는 기술을 설명합니다.

프로토콜

1. 세포외 플럭스 분석기를 사용한 생물 에너지학 경로를 위한 3D 췌장 종양 스페로이드의 대사 분석

참고: 이 섹션에서는 3D 스페로이드를 위해 특별히 설계된 분석 마이크로플레이트가 있는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 스페로이드의 대사 기능을 분석합니다.

1. 성장 플레이트에서 스페로이드 분석 마이크로플레이트로 스페로이드 세척 및 이동.
   메모: 스페로이드는 직경이 ~500μm에 도달할 때 대사 분석에 사용할 수 있습니다.
   1. 분석을 수행하기 전날, 제공된 유틸리티 플레이트에 분석 보정제(200μL/well)로 프로브 또는 센서 카트리지를 수화하고 37°C로 설정된 가습 인큐베이터(non-CO₂)에서 밤새도록(4-18시간) 배양합니다.
   2. 해당과정 스트레스 테스트(GST) 분석을 위해 2mM L-글루타민을 기본 배지(재료 표 참조)에 보충하거나 미토콘드리아 스트레스 테스트(MST) 분석을 위해 1mM 피루베이트, 2mM L-글루타민 및 10mM 포도당을 보충하여 원하는 대사 분석에 적합한 분석 배지를 준비합니다.
      메모: 세포외 플럭스 분석기는 96웰 플레이트 형식으로 살아있는 세포의 미토콘드리아 호흡(OCR)과 해당작용(ECAR)을 모두 측정합니다. 이러한 비율은 조사 중인 샘플의 세포 대사 기능에 대한 개요를 제공합니다. 자세한 지침은 분석 키트의 설명서를 참조하십시오.
   3. 분석 특정 보충제를 추가한 후(단계 1.1.1 참조), 보충된 분석 매체를 37°C 수조에서 가열하고 0.1N NaOH로 pH를 7.4 ± 0.1로 조정합니다. 사용할 때까지 매체를 따뜻하게 유지하십시오.
   4. 보정된 분석 배지에서 분석 키트 시약을 권장 재고 농도로 재구성합니다.
      메모: 이들은 우물에서 원하는 최종 농도의 10×에서 만들어집니다. 포도당, 올리고마이신 및 2-데옥시글루코스(2-DG)의 스톡 농도는 각각 100mM, 100μM 및 500mM입니다.
   5. 스페로이드의 형태와 전반적인 균일성을 확인하기 위해 광 현미경으로 성장판의 스페로이드를 관찰합니다.스페로이드의 모양과 구조 측면에서.
   6. 성장판을 자기 홀딩 드라이브로 옮기고 ~120μL 성장 배지를 조심스럽게 흡입합니다. ~120 μL의 예열 및 사전 보정된 분석 매체로 스페로이드를 부드럽게 세척하고 흡인 및 세척을 두 번 반복합니다. 현미경으로 스페로이드를 다시 검사하여 스페로이드가 씻겨 나가지 않았는지 확인합니다.
   7. 각 웰에 180μL의 따뜻한 분석 매체를 추가하여 스페로이드 분석 마이크로플레이트를 준비합니다.
   8. P20 마이크로피펫을 10 μL로 설정하고 구멍이 뚫린 넓은 팁을 끼웁니다. 넓은 구멍 끝을 사용할 수 없는 경우 깨끗한 가위나 메스로 일반 피펫 팁의 끝을 잘라 구멍을 넓히십시오.
      메모: 이는 전단을 줄이고 스페로이드의 전반적인 형태를 보존하는 동시에 분석 플레이트로 전달되어야 합니다.
   9. 따뜻한(37°C) 표면을 사용하여 스페로이드를 전사합니다. 백색광 램프로 데워진 X-ray 필름 뷰어 표면을 사용하여 콘트라스트를 향상시키고 전사체를 시각화하는 데 도움을 줍니다.
   10. 넓은 보어 팁이 장착된 P20 마이크로피펫을 사용하여 세포 기피 성장 플레이트에서 사전 세척된 단일 스페로이드를 조심스럽게 흡인하고 대사 분석을 수행하기 위해 스페로이드 분석 플레이트의 각 웰 중앙으로 스페로이드를 직접 부드럽게 옮깁니다. 각 스페로이드가 순수한 중력에 의해 각 웰의 중앙 마이크로 챔버로 부드럽게 떨어지도록 하여 분석 플레이트를 채웁니다.
       메모: 각 스페로이드가 중력에 의해 우물 중앙으로 떨어지는 데 일반적으로 5-8초가 걸립니다. 스페로이드가 마이크로 챔버에 가라앉을 때까지 피펫을 꺼내지 마십시오. 분석 플레이트의 4개 모서리 웰(A1, A12, H1, H12)은 배경 웰로 사용되므로 스페로이드를 증착하지 마십시오.
   11. 각 스페로이드의 형태와 위치를 모니터링하여 각 스페로이드가 각 웰의 중앙에 있는지 확인합니다. 필요한 경우 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 스페로이드를 흡인하여 웰 중앙으로 재배치한 다음 중력에 의해 증착합니다.
   12. 모든 스페로이드가 옮겨지면 분석 전 1시간 동안 분석 플레이트를 37°C 가습 공기 인큐베이터(non-CO₂)에 놓습니다.
2. 센서 카트리지에 화합물을 넣고 분석을 수행합니다.
   1. 1.1.2단계에서 설명한 분석 특정 매체에서 10× 농도의 분석 특정 시약을 준비합니다. 예를 들어, GST를 수행하려면 포도당, 올리고마이신 및 2-DG를 분석 설명서에 언급된 권장 부피로 재구성합니다. GST 및 MST 분석은 모두 Patu8902-PS1 스페로이드를 사용하여 수행되었습니다.
   2. 왼쪽에 AH라고 표시된 행이 있는 센서 카트리지의 방향을 올바르게 지정하고 센서 카트리지 위에 로딩 가이드를 놓습니다. 적재할 포트에 해당하는 문자가 왼쪽 상단 모서리에 있도록 적재 가이드의 방향을 지정하여 원하는 포트가 올바르게 적재되도록 합니다.
   3. 멀티채널 피펫을 사용하여 시약을 주입 포트에 직접 분주합니다. 절차 내내 손가락 끝을 사용하여 로딩 가이드를 제자리에 고정합니다.
      메모: 각 시약은 분석 설명서에 언급된 권장 포트에 주입됩니다. 기포가 생성되지 않도록 하되 기포를 제거하기 위해 카트리지의 어떤 부분도 두드리지 마십시오.
   4. 로딩 가이드를 제거하고 카트리지와 함께 눈높이에 위치시켜 주입 포트가 균일하게 로딩되는지 육안으로 검사합니다.
   5. 섹션 1.3에 설명된 대로 기기 컨트롤러 Wave 소프트웨어(이하 분석 소프트웨어)를 사용하여 실험 분석 설계/기기 프로토콜을 생성합니다.
3. 분석 소프트웨어를 사용한 분석 설계 및 실행
   1. 실험을 위한 분석 템플릿 만들기
      1. 분석 소프트웨어를 열고 "템플릿"을 클릭하거나 기존 분석 템플릿에서 선택합니다. "Blank Template"을 두 번 클릭합니다.
      2. 실험 그룹과 조건을 정의합니다.
         1. 포트 A, B 및 C에 대한 주입 전략을 정의합니다. 포트 D는 비워 둡니다..
            메모: GST 분석의 경우 이러한 포트에만 Glucose, Oligomycin 및 2-DG가 로드됩니다. MST 분석의 경우 올리고마이신, FCCP 및 로테논이 로드됩니다.
         2. 스페로이드가 하나 이상의 테스트 화합물과 대조군으로 처리된 경우 전처리를 정의합니다. 분석 매체를 정의하여 소스, 보충제 및 기타 정보를 포함합니다.
         3. 밀도 및 계대 수 정보를 보는 하나 이상의 세포 유형(예: Patu8902, PS1)을 정의합니다.
      3. "Generate Groups(그룹 생성)"를 클릭합니다.
      4. "Plate Map" 탭을 클릭하고 실험 설계에 해당하는 분석 플레이트에 그룹을 할당합니다.
      5. 네 모서리 웰을 배경 웰로 선택합니다. 이 웰에 스페로이드가 없는지 확인하십시오.
4. 분석기에서 분석 실행
   1. Instrument Protocol 탭을 클릭합니다. "Calibrate", "Equilibrate" 및 "Baseline Measurement Cycle"을 선택하여 기본 프로토콜 명령을 유지합니다.
   2. "Injections"를 클릭하고 각 포트에 대한 화합물을 정의합니다. 측정 주기를 스페로이드에 대한 기본 3 주기에서 6 주기로 편집합니다. 기본 3분 믹스, 0분 대기 및 3분 측정 시간을 유지합니다.
      메모: 기본 혼합-대기-측정 시간은 각각 3분, 0분, 3분입니다. 일반적으로 첫 번째 분석 화합물을 주입하기 전에 세 가지 basal rate 측정이 수행됩니다. 이러한 측정은 실험 설계에 따라 보정 및 재조정할 수 있습니다.
   3. 프로토콜 및 그룹 요약을 검토합니다.
   4. 어세이 설계 템플릿을 저장합니다.
   5. 주입 포트에 분석 기질이 로드된 후 사전 분석 보정을 진행합니다. 유틸리티 플레이트가 있는 카트리지를 세포외 플럭스 분석기로 옮깁니다.
      메모: 이 작업은 일반적으로 15-20분 이내에 완료되며 센서를 보정하여 OCR 및 ECAR 측정을 수행합니다.
   6. 카트리지를 보정한 후 유틸리티 플레이트를 3D 스페로이드가 포함된 예열된 분석 플레이트로 교체하고 분석을 시작합니다. 측정이 완료된 후 데이터를 스프레드시트 또는 그래프 및 통계 소프트웨어로 내보내 데이터를 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 세포 발피제 플레이트	USA 사이언티픽/그리너 바이오 원	655970	스페로이드 성장판
D-포도당	시그마	D9434
디피에스	지브코	14190-144
해당과정 스트레스 테스트 키트	애질런트 테크놀로지스	103020-100
L-글루타민	시그마	59202씨
미토콘드리아 스트레스 테스트 키트	애질런트 테크놀로지스	제103015-100
Patu8902 셀	실험실 재고		췌관 선암종 세포
PS1 세포	실험실 재고		활성화된 췌장 성상 세포
RPMI1640	지브코	11875-093	세포용 성장 배지, 스페로이드
SeaHorse XFe 96 세포외 플럭스 분석기	애질런트 테크놀로지스		세포외 플럭스 분석기
나트륨 피루브산	시그마	S8636
XF 베이스 미디어	애질런트 테크놀로지스	제102365-100	XFe 96의 대사 분석을 위한 기본 배지

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