PDAC 줄기세포 분리: 췌장 종양에서 암 줄기세포를 분리하는 방법

초록

출처: Lonardo, E., et al. 새로운 치료 전략 개발을 위한 췌장암 줄기세포 특성 연구. J. Vis. 특급 (2015).

이 기사에서는 인간 췌관 선암종(PDAC) 조직에서 췌장암 줄기세포(CSC)를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 CSC는 보다 효율적인 암 치료법을 개발하기 위해 CSC의 체외 자가 재생 능력에 대한 약물 치료의 기능적 효과를 연구하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. Human PDAC에서 CSC 격리(그림 1)

1. 멸균 생물 안전 캐비닛에서 인간 PDAC 조직을 1ml의 멸균 1X 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 60 x 15mm 배양 접시로 옮깁니다. 멸균 메스와 겸자를 사용하여 종양을 작은 조각(1 - 5 mm)으로 다집니다.
2. 배양 접시에 멸균 1X PBS 1ml를 추가하고 조직이 완전히 해리될 때까지 분쇄 단계를 반복하며, 정기적으로 3-4회가 필요합니다. 조직 현탁액(1X PBS로 최종 부피 5ml까지)을 멸균 튜브로 옮기고 gentleMACS와 같은 해리기로 기계적으로 균질화합니다.
3. 균질화된 조직을 콜라겐 분해 효소(1X PBS에 2.5mg/ml 콜라겐 분해 효소 사용)로 37°C에서 60분 동안 배양한 다음 900 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 완전한 배지 10ml에 재현탁합니다. 40μm 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하고 900 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액을 디캔팅하고 펠릿을 적혈구 용해 완충액 5ml(암모늄-염화-칼륨, ACK)로 재현탁시키고 배양합니다.
5. 펠릿을 CSC 배지에 재현탁하고 젤라틴으로 코팅된 접시에 담고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 이 단계는 플레이트에 빠르게 부착되는 대부분의 섬유아세포 세포를 제거합니다.
6. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 세포 현탁액을 조심스럽게 회수하고 혈구계를 사용하여 생존 가능한(trypan blue-negative) 세포의 수를 정량화합니다. 이를 위해 현탁액과 현탁액 20 μl를 Eppendorf tube에 부드럽게 혼합합니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 세포에 트리판 블루 20μl(1:1 비율)를 넣고 잘 섞습니다. 혼합물의 약 10 μl를 혈구계에 피펫팅합니다.
7. 생존 가능한 세포 수를 위해 계수 챔버의 4개 모서리 사분면 내에 있는 모든 투명 세포를 계수합니다.
   메모: 세포의 생존력과 수율은 종양 표본에 따라 상당히 다를 수 있습니다. PDAC 샘플의 경우 생존율은 일반적으로 45-70% 사이이며, 직경이 3 - 5mm인 거시적 종양 샘플의 조직 조각은 약 5x10⁶개의 생존 가능한 세포를 생성해야 합니다.

결과

그림 1. 메트포르민은 CSC를 선택적으로 표적으로 삼습니다.
(A) 메트포르민은 구체의 크기를 줄였습니다. 표시된 용량의 메트포르민을 7일 동안 투여한 후 얻은 구체의 대표 이미지(오른쪽 패널). 구 크기(n≥6)의 정량화(왼쪽 패널), 가로 좌표축에 표시된 숫자는 개별 종양을 나타냅니다. (B) 7일 동안 메트포르민의 존재 또는 부재 시(n≥6) 구 형성 능력, 가로 좌표축에 표시된 숫자는 개별 종양을 나타냅니다. (C) 원발성 췌장암 세포의 2차 및 3차 영역에서 CSC 자가 재생 능력의 대표 그래프. 구체는 1세대 구체 형성 동안에만 총 7일(n = 6) 동안 처리되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
계수 챔버 / 혈구계	Hausser Scientific Co (주	3200
증식 및 생존율 측정을 위한 CASY 세포 계수기 및 분석기	로슈 이노바티스	AG CASY 모델 TTC 45,60,150 μm
GentleMACS 분리기	Miltenyi Co (주	Tel.: 130-093-235
GentleMACS C 튜브	Miltenyi Co (주	Tel.: 130-093-237
100mm 조직 배양 접시	BD 팔콘	353803
세포 여과기	BD 팔콘	352350
15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브	BD 팔콘	352097
50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브	BD 팔콘	352070
1.5ml 멸균 튜브	에펜도르프	0030 120.086
50ml 원심분리기 튜브	코 닝	430828
멸균 페트리 접시, 10cm 접시	코 닝	353003
콜라겐분해효소 IV형	줄기세포 기술	7909
RPMI 미디엄 1640	생명 기술	11875-085
페니실린/스트렙토마이신 용액, 100X	생명 기술	SV30010
L-글루타민, 200mM, 100X	생명 기술	제25030-081
B27 보충제 50x	생명 기술	제17504-044
Basic Fibroblast 성장 인자	시그마	F0291
둘베코의 개조된 독수리 미디엄/F12	시그마	D8437
멸균 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수	시그마	D8537
트리판 블루	생명 기술	제15250-061
CO2 주입이 가능한 인큐베이터
마이크로 가위
곡선형 집게
파편 집게

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