Sphere Formation Assay: 췌장암 줄기세포 및 스크리닝 요법을 확인하기 위한 In Vitro 방법

1.Sphere Forming 분석 및 분석

1. Sphere Formation Assay 및 Metformin 처리
   1. 필요한 수의 세포를 취하고 적절한 부피의 CSC 배지를 추가하여 2,000 cells/ml의 세포 농도를 준비합니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 1시간 이상 보관하지 말고 도금하기 전에 잘 혼합하십시오.
   2. 매체 증발을 최소화하기 위해 가습을 위해 24웰 플레이트의 첫 번째 및 마지막 줄에 500μl의 1X PBS를 추가합니다. 세포를 1ml의 tumor sphere medium(2,000 cells/ml)에서 well당 2,000개의 세포 밀도로 ultra-low attachment cells plate에 파종합니다.
      메모: 종양 구체 형성 분석에 사용되는 세포의 수는 종양 유형에 따라 다를 수 있습니다.
   3. 최소 4개의 웰을 비히클(음성 대조군)로 처리하고 할당된 각 처리로 4웰(예: 3mM의 메트포르민)을 처리합니다. 세포를 37°C로 설정된 인큐베이터에 넣고 일주일 동안 세포에 5% CO₂를 공급합니다.
      메모: 종양 구체가 방해받지 않고 형성될 수 있도록 배지를 변경해서는 안 되지만, 배양 배지에서 안정적이지 않기 때문에 매일 성장 인자를 보충할 수 있습니다.
   4. 격일로 각 웰에 3mM의 메트포르민 또는 차량을 추가합니다. 더 큰 구조를 계수할 수 있는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 5일 및/또는 7일 후에 형성된 종양 구체의 수를 평가합니다(그림 1).
      메모: 최소 40 μm의 종양 구체만 고려해야 하며 각각 작은(40 - 80 μm) 또는 큰(80 - 120 μm)으로 분류할 수 있습니다. 결과는 종양 구체의 백분율을 파종된 세포의 초기 수(예: 2,000개 세포)로 나눈 값으로 설명할 수 있습니다.
2. 1세대 종양 구체의 연속 패시징(Serial Passaging of 1 Generation Tumor Spheres)
   1. 배양 7일 후, 40μm 세포 여과기를 사용하여 종양 구체를 채취하고 RT에서 900 x g으로 5분 동안 원심분리합니다.
   2. 트립신을 사용하여 종양 구체의 펠릿을 단일 세포로 해리한 다음 얻어진 단일 세포 현탁액을 다시 7일 동안 확장합니다.

그림 1. 메트포르민 처리는 산소 소비를 억제하고 ROS 생성을 유도합니다. (A) 메트포르민은 또한 구 유래 세포의 산소 소비(OCR)를 억제합니다. 두 개의 서로 다른 PDAC 2차 구체를 메트포르민으로 처리하고 세포 외 플럭스 분석을 통해 OCR 변화를 측정했습니다. 로테논 주사는 총 미토콘드리아 OCR 소비에 대한 대조군으로 사용되었습니다. X축은 각 웰의 단백질 함량에 의해 정규화된 산소/시간의 산소 소비율(pmol)을 나타냅니다. (B) A에 사용된 PDAC 구체는 메트포르민으로 8시간 동안 처리하고, ROS 생산은 카르복시-DCFDA를 사용한 유세포 분석으로 평가했습니다. 왼쪽, 대표적인 유세포 분석 플롯. 오른쪽, 세 가지 독립적인 실험의 데이터를 요약한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.