PTM 기반 종양 미세환경 모니터링: 종양 스페로이드를 사용하여 ECM 강성의 변화를 추적하는 방법

초록

출처: Jones, D. P., et al. 입자 추적 미세유변학을 사용한 3D 종양 모델에서 세포외 매트릭스 강성의 종단 측정. J. Vis. 특급 (2014).

이 프로토콜은 입자 추적 미세유변학(PTM)을 사용하여 세포 외 기질 강성 변화를 모니터링하는 기술을 설명합니다. 이는 비디오 입자 추적 및 분석을 위해 형광 프로브가 내장된 ECM으로 3D 췌장 종양 스페로이드를 배양하여 수행됩니다.

프로토콜

1. ECM에 내장 된 3D 종양 스페로이드 준비

1. 층류 후드 내부에 필요한 재료가 있는 워크 스테이션을 준비합니다.
2. 25:25의 멸균수에 2:1의 스톡 프로브(2% 고형물)를 첨가하여 카르복실레이트 변형 1μm 직경의 형광 추적 프로브의 희석된 혼합물을 준비합니다.
3. 냉장고에서 3.1mg/ml 소 콜라겐 한 병을 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다.
4. 콜라겐 125μl를 빈 2ml 바이알에 분주합니다.
5. 콜라겐과 와류가 들어 있는 바이알에 희석된 추적 프로브 용액 50μl를 잠시 첨가하여 프로브를 분배합니다.
6. 총 부피 410ml에 대해 페놀 레드(노란색으로 변함)를 포함하는 적절한 세포 배양 배지 235μl를 추가하고 205ml(총 부피의 절반)를 제거하고 새 2ml 바이알에 넣기 전에 잠시 소용돌이칩니다. 바이알 1에는 종양 스페로이드가 함유되어 있고 바이알 2에는 대조군 혼합물이 함유되어 있습니다.
7. 바이알 1에 ~2μl의 1M NaOH를 추가하여 용액을 중성 pH로 되돌립니다(페놀 레드를 포함하는 배양 배지는 빨간색으로 돌아가야 함). 이렇게 하면 혼합물을 얼음 위에 보관하지 않으면 경화가 시작됩니다. 소용돌이를 잠시 섞은 다음 즉시 얼음 선반으로 돌아갑니다.
   메모: 스페로이드는 배양 9일 후 육안으로 거의 보이지 않으며 아가로스 층에서 제거하는 것은 섬세한 작업입니다. 일부 사용자에게는 해부 현미경을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이송 중 스페로이드의 무결성을 유지하는 것이 가장 중요합니다.
8. 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 종양 스페로이드가 들어 있는 웰에서 40μl의 배지를 부드럽게 제거합니다. 다음 단계를 수행하는 동안 이 40μl를 유지하십시오.
9. 이전 단계에서 스페로이드가 제거되었는지 웰을 확인합니다. 그렇다면 스페로이드가 포함된 40μl를 바이알 1에 첨가합니다. 그렇지 않은 경우 40μl를 웰에 다시 넣고 이전 단계를 반복합니다.
10. 바이알 1을 부드럽게 저어주어(와류가 발생할 위험이 없으므로 스페로이드가 손상될 수 있음) 혼합물을 60μl 부분으로 96웰 플레이트의 별도 웰 3개로 옮깁니다. 혼합물을 첨가한 후 현미경으로 각 웰을 검사하여 어떤 웰에 스페로이드가 포함되어 있는지 확인합니다.
11. ~2μl, 1M, NaOH 및 40μl의 세포 배양 배지를 바이알 2 및 와류에 추가한 후 이 혼합물 60μl를 96웰 플레이트의 빈 웰에 분취하고 대조군으로 라벨링합니다.
12. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣어 최소 1시간 동안 경화시킵니다.

2. 샘플 포인트의 그리드를 구성하고 각 포인트에서 비디오를 찍습니다.

1. 샘플 플레이트를 인큐베이터에서 현미경 스테이지로 옮깁니다. 10분 동안 허용amp가열된 경우 s가 실온과 평형을 이룹니다.tage를 사용할 수 없습니다.
2. 저전력 대물 렌즈로 샘플을 관찰하여 손상되지 않고 이미징 준비가 되었는지 확인하십시오. 웰 내의 종양 위치를 확인합니다.
3. 얼마나 많은 표본 점을 취할지 결정합니다. 일반적으로 스페로이드 주위에 동심원 고리로 분포된 각 웰에 있는 20개의 샘플 포인트는 적절하게 상세한 결과를 생성합니다.
4. 스테이지를 원하는 각 위치로 이동하고 현미경 인터페이스 소프트웨어를 사용하여 x 및 y 좌표를 기록합니다(또는 인터페이스 소프트웨어를 사용할 수 없는 경우 수동으로 좌표를 기록
).
5. 현미경을 고출력 대물 렌즈(일반적으로 100X)로 전환하고 추적 프로브의 여기 파장에 적합한 필터 큐브를 선택합니다. 2.4단계에서 만든 포인트 목록을 사용하여 그리드의 첫 번째 포인트로 이동합니다.
6. 초점을 조정하여 웰의 바닥을 찾은 다음 위로 이동하여 여러 초점이 맞는 추적 프로브가 포함된 시야(FOV)를 찾습니다.
7. 강도 히스토그램을 관찰하고 노출 강도와 시간을 조정하여 이미지가 포화되지 않도록 하면서 가능한 최대 동적 범위를 제공합니다.
8. 프레임당 20-30msec의 프레임 속도(각 공간 그리드 포인트에서 수집 시간을 최소화해야 할 필요성과 균형을 이루는 강력한 MSD 계산을 위한 충분한 통계를 제공하기 위해 약 800프레임 또는 16-24초 길이 권장)로 비디오 시퀀스를 얻고 적절한 규칙에 따라 저장합니다. 녹음하는 동안 현미경이나 테이블을 만지지 마십시오.
9. 그리드의 각 샘플 점에 대해 2.6-2.9단계를 반복합니다.
10. 실험의 각 웰에 대해 2.3-2.10단계를 반복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 1형 콜라겐	BD Biosciences, 산호세, CA	354231
팬크-1	미국식 세포 배양, 버지니아주 머내서스	CRL1469	또는 다른 적절한 세포 유형
형광 마이크로스피어	Life Technologies, 칼즈배드, 캘리포니아	906906
아가로스	Fisher Bioreagents, 매사추세츠주 월섬	C12H18O9
나오	Fisher Bioreagents, 매사추세츠주 월섬	NC0480985
96웰 이미징 플레이트	Corning Inc., 뉴욕 코닝	3904
DMEM을 참조하십시오.	Hyclone, 매사추세츠주 월섬	SH30243.01	또는 적절한 세포 배양 배지
Zeiss AxioObsever 현미경	Zeiss, 독일 오버코헨		고속 카메라 및 이미징 소프트웨어 포함

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