DNA 손상 병소 평가: 면역형광 염색을 사용하여 암 세포주에서 방사선 유도 DNA 손상 병소 식별

초록

출처: Maliszewska-Olejniczak et al. 인간 결장암 세포에서 DNA 손상 및 복구 초점의 면역형광 이미징. J. Vis. 특급. (2020).

이 비디오는 면역형광 염색을 사용하여 대장암 세포주에서 방사선 유도 DNA 복구 병소를 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. DNA 복구 단백질은 DNA 손상 부위에서 활성화됩니다. 따라서 특정 항체를 사용하여 이를 검출하고 형광 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 배양 준비 및 실험 설정

1. 공급업체가 권장하는 대로 인간 대장암 세포인 HCT-116을 10% 소 태아 혈청과 1% 항생제 항진균 용액이 보충된 10mL의 McCoy's 5a Medium Modified 제형이 포함된 75cm² 배양 플라스크의 단층으로 유지합니다.
2. 37°C의 가습된 5% CO₂ 환경에서 70% 포화도까지 2-3일마다 중간 재생으로 세포를 성장시킵니다.
3. 암세포를 무거운 입자로 사멸시키는 BNCT 빔(예: 중성자빔과 BPA) 및 BNCT 효과를 얻고 대부분의 에너지를 붕소 함유 암세포 내에 증착하기 위해 방사선 조사 전날 세포 배양 배지에 붕소 전달제(예: ¹⁰BPA, 4-Borono-L-phenylalanine, 10 μg ¹⁰B/mL, 0.925 mM 최종) 방사선 조사 전 12-16 시간 (붕소의 최대 흡수) .
   메모: BNCT 연구의 경우 데이터가 없는 다른 세포주를 사용하는 경우 최적의 붕소 농도를 얻기 위해 각 세포주에 대한 붕소 흡수를 테스트합니다. Dagrosa 그룹에서 수행한 유도 결합 플라즈마 발광 분광법(ICP-OES)으로 BPA 세포 흡수를 측정합니다.
4. 붕소 전달 12-16시간 후 배지를 흡인하고 1x PBS 10mL로 세포를 세척합니다. 그런 다음 세포에 2mL의 Trypsin-EDTA 용액을 첨가하여 세포를 트립신화하고 37°C에서 5분 동안 배양하여 세포 분리를 향상시킵니다. 세포가 분리되기 시작하면 10mL의 완전한 배지를 추가하여 트립신 작용을 중지합니다.
5. 15mL 튜브의 세포 현탁액을 흡인하고 10μL의 세포에 10μL의 0.4% 트리판 블루를 첨가하고 혼합한 다음 계수 슬라이드에서 10μL를 분취하여 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포 현탁액을 배지의 1 x 10⁶ cells/mL 농도로 희석합니다. cryotube당 세포 현탁액 1mL를 분취합니다.
6. 감마선 선량 측정을 위한 열발광 선량계(TLD)와 중성자 플루엔시스에 대한 금박을 준비하고 조사 전에 TLD를 극저온 튜브 또는 세포 배양 플라스크에 부착합니다.
7. 시설 성능에 따라 배양 플라스크 또는 극저온 튜브에서 권장되는 최소 열 중성자 플럭스인 5.9 x 10¹¹ (n/^{cm-2 min-1})⁴에서 1 x 10⁶ cells/mL에 중성자 혼합 빔을 조사합니다.
   메모: 권장 중성자 플럭스를 얻기 위해 이전에 조사 시간을 설정하십시오.
8. 방사선 조사 후 35mm 페트리 접시 또는 6웰 플레이트의 22 x 22mm 커버슬립에 조사된 세포 1mL(1 x 10⁶ cells/mL)를 시딩하고 필요한 배지 2mL를 보충합니다. 가습된 5% CO₂ 환경에서 37°C에서 최대 3시간 동안 세포를 배양하여 커버슬립에 부착되도록 합니다. 20x objective.
   가 있는 도립 현미경으로 세포의 부착을 수시로 관찰합니다. 메모: HCT-116 세포의 경우 최소 밀도는 600,000개의 세포를 시딩하는 것입니다. 빠른 추가 염색 절차를 위해 챔버 슬라이드를 사용하고 그에 따라 세포 밀도를 줄이십시오.

2. 세포의 정착

1. 세포의 방사선 조사 및 배양 후, 부착된 세포에서 배지를 제거하고 PBS 2.5mL로 세포를 한 번 세척합니다.
2. RT.
   에서 10분 동안 1mL의 70% 에탄올로 세포 고정 메모: 또는 이전에 권장했던 대로 고정을 위해 1%-3.7% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하십시오. 여기서 프로토콜이 일시 중지되었습니다. 에탄올에 고정된 세포를 -20°C의 냉동고에 몇 주 이상 보관하지 않고 추가 분석 및 면역 형광 염색을 위해 보관합니다.

3. 세포의 투과화

1. 고정 후 페트리 접시에서 에탄올을 제거하고 2.5mL의 1x PBS.
   로 세척합니다. 메모: 헹굼 단계 사이에 세포가 건조되지 않도록 하십시오.
2. Triton X-100/PBS 0.2% 1mL를 부드럽게 첨가하여 페트리 접시의 세포로 커버슬립을 덮습니다.
3. RT에서 5분 동안 배양합니다.
4. 2.5 mL의 1x PBS.
   로 세포를 3x 세척합니다. 메모: 필요한 경우 PBS 내 Triton X-100의 비율을 최대 0.5%까지 증가시킵니다(더 많은 병소 검출 가능, 테스트된 세포주에 따라 다름). PBST(0.5% Tween의 PBS)로 추가 세척을 수행하여 불특이적 결합을 방지합니다.
5. PBS에 희석된 2% BSA(Bovine Serum Fraction V albumin) 1mL로 투과화 단계를 차단하고 1% BSA로 최소 30분 또는 1시간 동안 배양합니다.
   메모: 이 단계는 생략할 수 있으며 사용되는 항체 유형에 따라 다릅니다. 또는 권장 사항에 따라 5% FBS를 사용합니다.

4. 면역형광 염색

1. PBS에서 BSA(2% Bovine Serum Fraction V 알부민)와 함께 적당량의 1차 항체(Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs, Anti-Rad52)를 권장량에 따라 첨가합니다(권장 희석액이 포함된 표 1 참조)(샘플당 100μL 필요).

개 개

1차 항체	기능	권장 희석	보관 [°C]
안티-H2AX	DNA-DSB 검출	1시 1000분 (PBS-BSA)	4
안티 DNA-PKcs	NHEJ에 속하는 DNA-PKcs 단백질의 RIFs 검출	1시 200분(PBS-BSA)	-20
안티 Rad52	HRR에 속하는 Rad52 단백질의 RIF 검출	1시 200분(PBS-BSA)	-20
2차 항체		정보에 어두운
안티 마우스 IgG FITC	ɣ-H2AX 초점	1시 400분(PBS-BSA)	4
염소 안티-래빗 IgG H&L (Alexa Fluor 488)	NHEJ 및 HRR 복구 단백질 병소용	1시 500분(PBS-BSA)	-20

표 1: 섹션에서 사용된 항체 사용을 위한 권장 희석 및 참고 사항

2. 증류수를 사용하여 촉촉한 리그닌이 담긴 플라스틱 상자에 페트리 접시를 덮어 습도를 유지하고 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 배양은 4°C에서 밤새 수행할 수 있습니다.
3. 배양 후 2.5mL의 PBS.
   로 3회 세척을 수행합니다. 메모: 헹굼 단계에서 슬라이드가 건조되지 않도록 하십시오.
4. PBS에서 BSA로 희석한 적절한 양의 2차 항체(anti-mouse IgG FITC, Goat Anti-Rabbit IgG(Alexa Fluor 488)를 BSA로 추가합니다(표 1 참조)(샘플당 100μL 필요). 이 단계와 다음 단계에서는 어두운 곳에서 작업합니다.
5. 페트리 접시를 다시 덮어 습도를 유지하기 위해 수분 공급이 가능한 리그닌이 든 플라스틱 상자에 넣고 인큐베이터에서 30°C에서 최소 37분 동안 배양합니다.
6. 배양 후 2.5mL의 PBS로 3회 세척합니다.
7. PBS에 희석된 DAPI 100μL를 최종 농도 1μg/mL에 첨가하여 핵을 대조염색합니다.
8. RT에서 최대 2분 동안 잠깐 배양합니다.
9. 배양 후 2.5mL의 PBS로 3회 세척합니다.
10. PBS를 제거하고 기포 형성을 피하고 커버 슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 장착 매체 상단에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 바니시가 마를 때까지 기다렸다가 커버 슬립을 페인트하십시오.
11. 형광 현미경 검사에서 이미지를 분석하기 전에 장착 매체가 경화될 때까지(최대 3시간) 기다립니다.
    메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 유리 슬라이드는 플라스틱 상자에 넣어 어두운 곳에서 4°C에서 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12mm 커버슬립	폭스바겐	89015-725
35mm 페트리 접시	사르슈테트	7.183.390.000
4-Borono-L-페닐알라닌	시그마-알드리치	17755
항생제-항진균제(100X)	지브코	15240062
Anti-DNA PKcs (phospho S2056) 항체 - ChIP 등급	아브캠	AB18192
Anti-Mouse IgG(전체 분자)– 염소에서 생성된 FITC 항체	시그마-알드리치	F0257
안티 포스포 히스톤 H2A. X (Ser139) 항체, 클론 JBW301	머크밀리포어	제05-636
Anti-RAD52 항체	아브캠	AB117097
소 혈청 알부민 분획 V (BSA)	로슈	BSAV-RO
다피 (4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)	ThermoFisher 사이언티픽	D1306 (영어
소 태아 혈청 (열 비활성화)	시그마-알드리치	F9665
염소 안티-래빗 IgG H&L (Alexa Fluor 488)	아브캠	AB150077
HCT-116 세포주	증권 시세	CCL-247™
이미지J	미국 국립보건원(NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/
이미지 프로	미디어 사이버네틱스	https://www.mediacy.com/imagepro
현미경 슬라이드	ThermoFisher 사이언티픽	나-1198
인산염 완충 식염수(PBS)	Hirszfeld 면역학 및 실험 치료 연구소, PAS	20.59.52.0
트리톤 X-100	시그마-알드리치	엑스100
트리판 블루 스테인, 0.4%	로고스 바이오시스템즈	T13001
트립신-EDTA 용액 0.25%	시그마-알드리치	T4049

년 호 ) 표시기