DCFH-DA 염색을 통한 ROS 검출: 대장암 세포주에서 총 ROS 측정

초록

출처: Kim, H., et al. 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate 염색에 의한 부착 세포의 총 반응성 산소 종 검출. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 활성 산소 종(ROS)을 감지하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 형광 현미경을 사용하여 부착 세포의 ROS 국소화를 시각화하고 형광 플레이트 리더를 사용하여 ROS 강도를 추가로 정량화하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 세포 파종

1. 24-well plate에 웰당 2 x 10⁵ HCT116 대장암 세포를 시딩하고 37°C에서 밤새 Dulbecco의 DMEM(modified Eagle medium)의 세포를 유지합니다.
2. 배지를 함유한 100μM 황산제일철(FS) 또는 10μM 독소루비신(DOX)을 함유하거나 포함하지 않은 배양 배지를 교체하고 24시간 동안 배양합니다.

2. DCFH-DA 솔루션 준비

1. 1mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 4.85mg의 DCFH-DA를 용해시켜 10mM의 원액을 만듭니다.
2. 예열된 DMEM으로 원액을 웰에 추가하기 직전에 10μM 작업 용액으로 희석합니다.
3. Vortex는 10초 동안 작업 솔루션을 사용합니다.

3. DCFH-DA 염색

1. 약물 함유 배지를 제거하고 DMEM으로 한 번 세척합니다.
2. DCFH-DA 작업 용액 500μL를 각 웰에 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
3. DCFH-DA 작업 솔루션을 제거합니다. DMEM으로 한 번 세척하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 2번 세척합니다.
4. 각 웰에 500μL의 1x PBS를 추가합니다.

4. 이미징 획득 및 강도 측정

1. 형광 현미경에서 녹색 형광 단백질(GFP) 채널을 사용하여 각 웰에 대한 대표적인 형광 이미지를 촬영합니다.
2. 이미지 촬영 후 PBS를 제거하고 각 웰에 200μL의 방사성 면역침전 분석(RIPA) 버퍼를 추가합니다.
3. 얼음에서 5분 동안 배양한 다음 세포 용해물을 1.5mL 튜브에 모읍니다.
4. 21,130 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기.
5. 100μL의 상등액을 검은색 96웰 플레이트로 옮기고 485nm의 여기 파장과 530nm의 방출 파장에서 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 강도를 측정합니다.
6. Bradford 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정하기 위해 100μL의 1x 단백질 분석 용액이 들어 있는 투명한 96웰 플레이트로 상등액 1μL를 옮깁니다.
7. 단백질 농도로 형광 강도를 정규화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트	Cayman Chemical, 미시간주 앤아버	20656
독소루비신 염산염	TCI America, 오리건주 포틀랜드	D4193-25MG
둘베코의 변형된 독수리 매체	코닝, 코닝, 뉴욕	45000-304
Invitrogen EVOS FL 자동 이미징 시스템	Thermo Fisher Scientific 매사추세츠주 월섬	AMAFD1000	또는 다른 형광 현미경
단백질 분석 Bradford 솔루션	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	5000001
SpectraMax M2 마이크로플레이트 리더	분자 장치, Radnor, PA	89429-532	또는 다른 형광 마이크로플레이트 리더
철 황산염 Heptahydrate	VWR, 래드너, 펜실베이니아	97061-542

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