대장암의 PDOX 마우스 모델 생성: 쥐 모델에서 대장암의 진행 연구

초록

출처: Moret, R. et al. 인간 요로상피 세포 암종 및 결장직장암 종양 성장 및 자연 전이에 대한 환자 유래 정형소 이종 이식 모델. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 비만이 아닌 당뇨병/중증 복합 면역결핍증(NOD/SCID) 마우스에서 결장직장암 세포의 진행을 연구하기 위해 환자 유래 정형외과 이종이식 결장직장암 마우스 모델을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 쥐 모델은 원발성 종양 성장 및 전이 패턴을 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 세포주 배양

1. 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청, 2nM 글루타민, 100U/mL 페니실린 G 및 100mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 완전한 RPMI-1640 배지에서 HK 세포를 성장시킵니다.
   메모: HK 세포는 정상적인 인간 여포 수지상 세포이며 in vitro에서 ≤ 15 계대까지 성장 및 확장될 수 있습니다.

2. 루시페라아제 라벨링된 종양의 태깅 및 농축

1. 6-8주 된 암컷 NOD/SCID 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 측면에 종양을 직접 이식합니다.
2. 디지털 캘리퍼를 사용하여 격주로 종양 성장을 측정합니다.
3. 직경 1cm에서 종양을 형질주입합니다. 27G 바늘이 있는 1cc 주사기를 사용하여 Luc/적색 형광 단백질(RFP)-렌티바이러스(50μL/종양, 농축된 고역가 렌티바이러스 스톡에서 1:30 희석)를 종양에 직접 주입합니다.
   메모: 환자의 종양은 일반적으로 1-2개월 내에 직경이 1cm에 이릅니다. 그러나 성장 속도는 매우 다양하며 종양 등급 및 유형을 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다.

3. CRC 마우스 모델

1. 생후 6-8주 된 수컷 NOD/SCID 마우스에 이소플루란(100% 산소 중 2.5%, 1L/분)을 주입실에서 마취합니다. 발가락 꼬집기로 진정제를 확인하십시오.
2. 마취된 마우스를 누운 자세로 해부 현미경 아래에 놓고 주둥이를 이소플루란 콧방울에 고정하고 앞다리를 테이프로 고정하여 안정성을 확보합니다.
   메모: 해부 현미경 대신 루페를 사용할 수 있습니다. 작은 물체를 사용하여 꼬리 밑둥 아래에 놓을 때 가시성과 각도를 개선하여 항문을 들어 올릴 수 있습니다. 일반적으로 거즈의 작은 부분은 직경 1인치의 실린더 모양으로 말립니다.
3. 구부러진 윤활 처리된 뭉툭한 집게로 항문관을 확장하여 원위 항문과 직장 점막을 노출시킵니다. 대변을 제거하십시오.
4. 50μL 유리 주사기에 멸균 30G 탈착식 바늘을 사용하여 10μL의 루시퍼라제 태그가 지정된 종양 세포와 HK 세포(완전한 RPMI 배지에서 CRC 모델의 경우 마우스당 10μL의 종양 세포를 재현탁)를 항문관 위 1-2mm의 원위 후방 직장 점막하에 주입합니다. 바늘의 경사는 점막으로 덮여 있어야 합니다. 골반강으로 들어가지 않도록 주의한다.
5. 이소플루란 노즈콘에서 마우스를 분리합니다. 절차에 따라 1시간 동안 관찰하십시오. 고통의 징후, 즉 구부정한 등, 호흡 곤란 등을 찾으십시오.

4. 생물 발광 이미징

1. 루시페라아제 활성을 위한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 원발성 종양, 간 및 폐 전이 부담을 매주 모니터링합니다.
   1. 마우스 CRC 실험을 수행하고 무게를 잰다. 150mg/kg 루시페린을 복강내로 주입하고 기질이 마우스의 몸에서 순환할 때까지 5분 동안 기다립니다.
   2. 100% 산소에 2.5% 이소플루란, 유도 챔버에서 1L/분으로 마우스를 마취합니다.
   3. 코가 노즈콘에 고정된 상태로 BLI 이미징 기계에 마우스를 놓습니다. 이미지를 위해 노출할 때 관심 영역이 카메라를 향하고 있는지 확인하십시오. CRC 주입의 경우 각 이미지에 대해 복부 쪽이 카메라를 향해야 합니다. 누운 위치에 있는 마우스를 이미지화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI-1640 미디엄	아메리칸 타입 컬처 컬렉션	110636
이소플루란	Henry Schein 동물 건강	108333
D-루시페린(150mg/kg)	퍼킨 엘머	122796
글루타민 (2 nM)	피셔 사이언티픽	35050061
Luc/RFP-렌티바이러스	공동 작업자로부터. 참고 문헌 13 참조: Gills, J. et al. 방광 종양 이식, 성장, 혈관 신생 및 전이의 인간 고급 요로 상피 세포 암종을 가능하게 하는 환자 유래 orthotopic 이종 이식 모델. 종양 표적. 9, 32718-32729, doi:10.18632/ oncotarget.26024 (2018).
페니실린/스트렙토마이신 100mL(100U/mL)	피셔 사이언티픽	15140-122
기체
100% 산소	에어가스 Inc	황소 USP200
100% 이산화탄소2	에어가스 Inc	CD USPE
마우스
6-8주 된 NOD/SCID 마우스(암컷)	잭슨 랩	1303
도구
15mL 원뿔형 튜브	사르슈테트	11799
150mm 조직 배양 접시	미국 사이언티픽 Inc	CC7682-3614
집게	대칭 외과 Inc	06-0011
수술용 가위	대칭 외과 Inc	2011년 02
설비
5% CO2 가습 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	3110
생물 발광(BLI) 이미징 기계	퍼킨 엘머	CLS136334
BLI 이미징 기계 소프트웨어	퍼킨 엘머	CLS136335
디지털 캘리퍼스	Fowler 도구 및 기기	54-115-330
해부 현미경	정밀 기기 LLC	(504) 228-0076
Isoflurane 유도 챔버	퍼킨 엘머	119038