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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. huA33-TCO 준비
참고: huA33-TCO의 합성은 이전에 보고된 바 있습니다. 그러나 독자의 편의를 위해 최적의 조건에 대한 조정과 함께 여기에 복제됩니다.
- 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에서 40mg/mL(0.15M) 농도의 건조 디메틸포름아미드(DMF)에 (E)-cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate(TCO-NHS)의 125μL 용액을 준비합니다. 이 용액은 향후 실험에 사용하기 위해 -80 °C에서 분주하고 동결 할 수 있습니다.
- 별도의 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 인산염 완충 식염수 1mL(PBS, 2.7mM 염화칼륨, 137mM 염화나트륨 및 11.9mM 인산칼륨, pH 7.4)에 huA33 5mg/mL 용액을 준비합니다.
- 0.1 M Na2CO3 의 작은 분취 (<5 μL)를 사용하여 항체 용액의 pH를 Step 1.2에서 8.8-9.0으로 조정한다. pH 종이 또는 미세 전극이 있는 pH 측정기를 사용하여 pH를 모니터링하고 pH가 9.0을 초과하지 않도록 주의하십시오.
- 1.3단계에서 설명한 항체 용액에 항체 양에 대해 TCO-NHS의 40몰 당량에 해당하는 부피를 천천히 추가합니다. 예를 들어, 용액에 5mg(30nmol)의 huA33이 있는 경우 TCO-NHS의 40mg/mL(0.15M) 용액 9.0μL(1.20μmol)를 추가합니다.
메모: TCO-NHS는 소수성입니다. 항체 용액에 첨가할 때는 침전을 방지하기 위해 천천히 교반하면서 첨가하십시오. 최종 반응 용액에서 부피 기준으로 10% DMF를 초과하지 마십시오.
- 반응물을 25°C의 온도 혼합기에서 1시간 동안 가벼운 교반(500rpm)으로 배양합니다.
- 1시간 후, 사전 포장된 일회용 크기 배제 탈염 컬럼을 사용하여 huA33-TCO 면역접합체를 정제합니다.
- 공급업체가 설명한 대로 크기 제외 컬럼을 평형화하여 보관 중에 컬럼에 존재하는 방부제를 제거합니다. 일반적인 절차에는 컬럼의 부피에 해당하는 PBS 부피(5 x 2.5mL의 PBS)로 컬럼을 5x 세척하는 것이 포함됩니다.
- 반응 혼합물을 크기 배제 컬럼에 추가하고 반응 혼합물의 부피를 기록합니다.
- 반응 혼합물이 컬럼에 들어간 후 적절한 양의 PBS를 첨가하여 컬럼에 추가된 용액의 총 부피를 최대 2.5mL까지 가져옵니다. 예를 들어, 접합 반응의 총 부피가 1.3mL인 경우 컬럼에 PBS 1.2mL를 추가로 추가합니다.
- PBS 2mL를 용리액으로 사용하여 생성물을 수집합니다.
메모: 이 단계에서는 2mL의 PBS, pH 7.4에서 최종 구성물 huA33-TCO를 얻을 수 있습니다.
- 280nm 파장을 모니터링하는 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 huA33-TCO의 농도를 측정합니다. 대부분의 IgG(ε280)에 대한 몰 흡광 계수는 210,000M-1cm-1입니다.
- 더 높은 농도의 면역접합체를 사용하는 용액을 원하는 경우 제조업체 지침에 따라 분자량이 50,000 컷오프된 원심 필터 장치를 사용하여 huA33-TCO 용액을 농축합니다.
메모: 많은 항체가 농축 중에 응집되거나 침전되는 것으로 알려져 있습니다. 새로운 항체로 이 절차를 시도할 때, 연구자들은 문헌 또는 해당 항체를 다룬 자신의 경험을 따라야 합니다.
- 완성된 huA33-TCO 면역접합체는 즉시 필요한 경우 어두운 곳에서 4°C로 보관하십시오. 향후 4일 이상 사용할 경우 어두운 곳에서 -80°C에서 보관하십시오.
메모: 이 지점은 절차에서 허용 가능한 중지 지점입니다. 완성된 huA33-TCO 면역접합체는 어두운 곳에서 -80°C에서 최소 6개월 동안 안정적으로 보관할 수 있어야 합니다.
2. Tz-PEG 7-NHBoc의 합성
- 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브에 5mg의 테트라진 N-하이드록시숙시니미딜 에스테르(Tz-NHS, 12.6μmol)를 0.15mL의 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO) 0.15mg에 용해시킵니다.
- 별도의 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 8mg의 Boc 보호 아미노 PEG 중합체 O-(2-Aminoethyl)-O'-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol(NHBoc-PEG7-NH2; 17.1μmol)을 0.15mL의 무수 DMSO에 용해시킵니다.
- Tz-NHS 용액에 3μL(21.3μmol, 1.7몰 당량)의 트리에틸아민(TEA)을 첨가하고 철저히 혼합합니다.
- 2.2단계의 NHBoc-PEG7-NH 2 용액에 핑크 테트라진 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 실온(RT)에서 30분 동안 약한 교반으로 배양합니다.
- 30 분 후, 반응 혼합물을 H2O에 1 : 1로 희석하고 역상 C18 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 사용하여 정제하여 Tz-PEG 7-NHBoc에서 미반응 Tz-NHS를 분리한다. Boc 보호 그룹의 조기 제거를 방지하기 위해 산이 없는 용제를 사용하십시오. 525 nm. />의 파장에서 Tz-PEG 7-NHBoc 및 Tz-NHS를 모두 모니터링합니다.
메모: 머무름 시간은 각 실험실의 HPLC 장비(펌프, 컬럼, 튜빙 등)에 따라 크게 달라지며 정제 전에 적절한 제어를 실행해야 합니다. 그러나, 예를 들자면, 30분 동안 5:95 MeCN/H2O(둘 다 첨가제 없음)에서 95:5 MeCN/H2O의 그래디언트, 1mL/분의 유속 및 분석적 4.6 mm x 250 mm C18 컬럼을 사용하는 경우, Tz-NHS 및 Tz-PEG 7-NHBoc의 머무름 시간은 약 16분 및 18분입니다. 각각.
- 액체 질소를 사용하여 수집된 HPLC 용리액을 동결하고 현재 동결된 수집 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 동결된 채취 튜브를 동결 건조기에 밤새 올려 놓고 HPLC 이동상을 제거합니다. 제품은 특징적인 밝은 분홍색 솔리드입니다 .
메모: 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 수집된 HPLC 용리액을 드라이아이스에서 또는 -80°C 냉동고에서 밤새 동결합니다.
3. Tz-PEG7-NH 2의 합성
- 2.6단계, Tz-PEG 7-NHBoc의 생성물에 1.5mL의 디클로로메탄(DCM)을 첨가하고 이 용액을 작은 둥근 바닥 플라스크에 옮깁니다.
- 3.1단계의 분홍색 용액에 0.25mL의 트리플루오로아세트산(TFA)을 적가합니다.
- 반응이 RT에서 30분 동안 가벼운 교반과 함께 배양되도록 합니다.
- 30분 후 회전 증발을 통해 용매를 증발시킵니다. 수조 온도 37°C를 초과하지 마십시오.
- 분홍색 점성 제품을 물 0.5mL로 재구성합니다.
- 역상 C18 HPLC를 사용하여 Boc 보호 전구체에서 Tz-PEG7-NH 2를 분리하여 생성물을 정제합니다. 525 nm.
의 파장에서 Tz-PEG 7-NHBoc 및 Tz-PEG7-NH 2를 모두 모니터링합니다.
메모: 머무름 시간은 각 실험실의 HPLC 장비(펌프, 컬럼, 튜빙 등)에 따라 크게 달라지며 정제 전에 적절한 제어를 실행해야 합니다. 그러나 예를 들자면, 30분 동안 5:95 MeCN/H2O(둘 다 0.1% TFA 포함)에서 95:5 MeCN/H2O의 그래디언트, 1mL/분의 유속 및 분석적 4.6 mm x 250 mm C18 컬럼을 사용하는 경우 Tz-PEG 7-NHBoc 및 Tz-PEG7-NH 2 의 머무름 시간은 약 18분 및 13분입니다. 각각.
- 액체 질소를 사용하여 수집된 HPLC 용리액을 동결하고 현재 동결된 수집 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 동결된 채취 튜브를 동결 건조기에 밤새 올려 놓고 HPLC 이동상을 제거합니다. 제품은 밝은 분홍색 솔리드가 될 것입니다.
- 3.7단계, Tz-PEG7-NH 2의 생성물을 150μL의 DMSO로 재구성하고 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 525nm 파장을 모니터링하는 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 Tz-PEG7-NH 2의 농도를 측정합니다. Tz-PEG7-NH 2 (ε525)의 몰 흡광 계수는 535 M-1 cm-1입니다.
4. Tz-PEG 7-DOTA의 합성
- Tz-PEG7-NH 2 (4.5 mg, 6.9 μmol)를 0.15 mL의 DMSO에 용해시킵니다 (또는 3.8 단계에서 만든 용액으로 진행).
- 4.1단계의 테트라진 함유 용액에 22몰 당량의 TEA(21μL, 0.15mmol)를 추가합니다.
- 10 mg (14.2 μmol)의 p-SCN-Bn-DOTA를 고체로 첨가하고 약 2 분 동안 또는 물질이 완전히 용해 될 때까지 용액을 와류로 가열합니다.
- 반응이 RT에서 30분 동안 가벼운 교반과 함께 배양되도록 합니다.
- 30 분 후, 반응을H2O에 1:1로 희석하고 역상 C18 HPLC를 사용하여 생성물을 정제하여 미반응 p-SCN-Bn-DOTA를 제거한다. p-SCN-Bn-DOTA는 254nm의 파장에서 모니터링할 수 있는 반면 Tz-PEG7-DOTA는 525nm의 파장에서 가장 잘 모니터링할 수 있습니다.
메모: 머무름 시간은 각 실험실의 HPLC 장비(펌프, 컬럼, 튜빙 등)에 따라 크게 달라지며, 정제 전에 적절한 제어를 실행해야 합니다. 그러나 예를 들자면, 30분 동안 5:95 MeCN/H2O(둘 다 0.1% TFA 포함)에서 95:5 MeCN/H2O의 그래디언트와 분석적 4.6 x 250 mm C18 컬럼을 사용하는 경우 Tz-PEG7-DOTA 및 p-SCN-Bn-DOTA는 각각 약 15.6분 및 16.1분의 머무름 시간을 갖습니다.
- 액체 질소를 사용하여 수집된 HPLC 용리액을 동결하고 현재 동결된 수집 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 동결된 채취 튜브를 동결 건조기에 밤새 올려 놓고 HPLC 이동상을 제거합니다. 제품은 밝은 분홍색 가루가 될 것입니다.
- 0.15mL의 DMSO에서 제품을 재구성하고 525nm 파장을 모니터링하는 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정합니다. Tz-PEG7-DOTA (ε525)의 몰 흡광 계수는 535 M-1 cm-1입니다.
- 핵자기공명법(NMR) 및 고분해능 질량분석법(HRMS)으로 최종 화합물을 분석하여 합성이 성공적이었는지 확인합니다. 이 연구에서 논의된 모든 화합물의 실험적으로 결정된 화학적 변화와 분자량에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
- 정제된 Tz-PEG7-DOTA 용액을 -80°C.
의 어두운 곳에 보관하십시오.
메모: 이 지점은 절차에서 허용 가능한 중지 지점입니다. 완성된 Tz-PEG7-DOTA 전구체는 이러한 조건에서 최소 1년 동안 안정적입니다.
5. 177Lu Tz-PEG 7-DOTA의 방사선 표지
주의: 프로토콜의 이 단계에는 방사능의 처리 및 조작이 포함됩니다. 이러한 단계를 수행하거나 방사능에 대한 다른 작업을 수행하기 전에 연구원은 해당 기관의 방사선 안전 부서와 상의해야 합니다. 전리 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취하십시오.
참고: 소량의 방사성 금속으로 작업할 때, 배위 부위 결합에 대한 간섭을 방지하기 위해 모든 버퍼에 미량 금속이 없는 것이 좋습니다.
- 1.7mL 원심분리 튜브에 1M HCl의 분취량으로 조정된 0.25M 암모늄 아세테이트 완충액 200μL를 pH 5.5.
로 추가합니다.
메모: 라벨링에 370MBq 미만의 활성을 사용하는 경우 사용되는 버퍼의 부피를 100μL로 줄여야 합니다.
- 원하는 양의 [177Lu]LuCl3를 버퍼 용액에 추가합니다. 추가되는 양은 실험에 참여한 피험자의 수와 투여되는 방사성 선량에 따라 달라집니다. 정제 단계에서 발생할 수 있는 방사능 손실에 대비하기 위한 예방 조치로 1-2회 추가 방사선 투여량을 추가하는 것이 좋습니다.
- 5.2단계에서 방사성 혼합물에 DMSO의 Tz-PEG 7-DOTA를 첨가합니다. Tz-PEG 7-DOTA의 양은 테스트 대상의 수에 따라 다릅니다. 이 항목에 대한 자세한 내용은 단계 6.2.2.2에서 확인할 수 있습니다.
- 용액을 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 50mM EDTA, pH 5.5를 이동상으로 사용하는 방사 순간 박층 크로마토그래피(radio-iTLC)를 사용하여 방사성 라벨링이 완료되었는지 확인합니다. 라벨링된 [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz는 기준선(Rf = 0)을 유지하는 반면, 자유 [177Lu]Lu3+는 EDTA에 의해 조정되고 용매 전면(Rf = 1.0)과 함께 이동합니다(그림 1B).
- 정량적 표지가 이루어지지 않으면 유리 방사성 금속을 조정하기 위해 리간드를 추가합니다. 또는 C18 카트리지를 사용하여 라벨이 표시된 [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz를 정제합니다. 사용에 대한 제조업체 지침을 따르십시오. 샘플 절차는 다음과 같습니다.
- 큰 주사기로 5mL의 에탄올을 카트리지에 천천히 통과시켜 카트리지를 프라임합니다. 그런 다음 5mL의 아세토니트릴을 통과시킨 다음 5mL의 탈이온(DI) H2O를 통과시킵니다.
- 5.3단계의 방사성 리간드 용액을 더 작은 주사기에 넣고 C18 카트리지에 천천히 주입합니다. 그런 다음 10mL의 DI H2O로 카트리지를 세척하여 결합되지 않은 [177Lu]LuCl3을 제거합니다.
- 500μL의 에탄올로 용리합니다. 건조 질소 또는 아르곤의 낮은 유속으로 10-15분 동안 용기를 통과시켜 최종 제품에서 에탄올을 제거합니다. 그 후, 6.2.2.2단계에서 결정된 부피로 식염수에 방사성 리간드를 재현탁합니다.
6. 생체 내 연구
주의: 섹션 5에서와 같이 프로토콜의 이 단계에는 방사능의 처리 및 조작이 포함됩니다. 이러한 단계를 수행하기 전에 연구자는 소속 기관의 방사선 안전 부서와 상의해야 합니다. 전리 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취하십시오.
- 동물의 준비
- 암컷 흉선 누드 마우스에서 세포 배지와 매트릭스(예: Matrigel)의 1:1 혼합물 중 150μL에 현탁된 5 x 106 SW1222 결장직장암 세포를 피하에 이식하고 100-150mm3 이종이식편(접종 후 14-18일)으로 성장하도록 합니다.
- 생물 분포 실험을 위한 동물 분류
- 종양이 캘리퍼스 측정으로 결정된 대로 충분한 크기가 되면 각 코호트가 거의 동일한 평균 종양 부피를 갖도록 동물을 분류합니다. 동물은 각 케이지에서 지울 수 없는 잉크로 꼬리에 표시(밴드 1개, 밴드 2개 등)로 구별할 수 있습니다.
- 종단 치료 연구를 위한 동물 분류
- 캘리퍼스 측정으로 결정된 대로 종양의 크기가 충분해지면 실험 전반에 걸쳐 올바른 추적을 보장하기 위해 각 동물에 귀 태그를 부착합니다.
메모: 숫자 귀 태그는 실험 중에 떨어질 수 있습니다. 결과적으로 이러한 물리적 태그에 체계적인 방식(예: 오른쪽, 왼쪽, 양측, 오른쪽 x 2, 왼쪽 x 2)을 귀 노치와 함께 동반하는 것이 좋습니다.
- 각 코호트의 평균 종양 부피가 거의 같도록 동물을 분류합니다. 다음과 같은 동물 분류 방법은 스프레드시트 프로그램을 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 동물 식별 번호, 귀 노치 패턴 및 종양 부피를 세 개의 별도 열에 나열하십시오.
- 가장 작은 종양 부피에서 가장 큰 종양 부피로 데이터를 정렬합니다.
- 네 번째 열에서 각 동물에게 우리 번호를 할당하고 뱀 같은 패턴으로 우리를 순환합니다. 예를 들어, 5개의 케이지가 있는 경우 이 열은 모든 동물에게 케이지가 할당될 때까지 "5, 4, 3, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..."로 채워집니다.
- 케이지가 할당되면 케이지 번호별로 데이터를 정렬합니다. 귀 노치를 사용하는 경우 주어진 케이지의 각 동물이 고유한 귀 노치 패턴을 가지고 있는지 확인하십시오. 주어진 우리에 중복(동일한 패턴이 두 개 이상)있는 경우 모든 케이지에 고유한 귀 노치 패턴을 가진 동물이 있을 때까지 한 마우스를 패턴이 누락된 다른 케이지의 마우스로 교체합니다.
- 제형 및 주사제
메모: 생체 내 분포 및 치료 연구를 위한 주입 순서는 다음과 같이 진행됩니다: huA33-TCO를 먼저 주입한 다음 미리 결정된 간격 후에 [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz를 주입합니다.
- 면역접합체
- 단계 1.9의 huA33-TCO 용액 분취액을 0.9% 멸균 식염수 중 0.8mg/mL 농도로 희석합니다.
- PBS에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 전처리된 주사기에 150μL(100μg)의 huA33-TCO 용액을 추출하고 이 주사기를 얼음에 보관합니다.
메모: BSA 처리는 주사기 벽에 대한 항체의 비특이적 결합을 감소시킵니다.
- 꼬리 정맥을 확장하기 위해 열 램프로 동물을 3 분 동안 따뜻하게하십시오.
- huA33-TCO 용액을 이종이식 생쥐의 꼬리 정맥에 주입합니다. huA33-TCO가 마우스의 종양에 축적될 때까지 24시간(또는 미리 결정된 다른 시간 간격)을 허용합니다.
- 방사성 리간드
- 섹션 5에 설명된 Radiolabel Tz-PEG7-DOTA입니다.
- 투여된 huA33-TCO의 양에 비해 1.1몰 당량의 Tz-PEG 7-DOTA를 포함하는 0.9% 멸균 식염수 150μL에서 투여량을 추출합니다. 예를 들어, 100μg(0.67nmol)의 huA33-TCO를 동물에 주입하고 [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz 반응 혼합물을 12.4GBq/μmol의 특정 활성으로 만든 경우 각각 9.14MBq의 활성을 포함하는 투여량이 추출됩니다. 이는 0.74 nmol의 Tz(huA33-TCO에 비해 1.1 몰 식)에 해당합니다.
- 꼬리 정맥을 확장하기 위해 열 램프 아래에서 동물을 3분 동안 따뜻하게 합니다.
- 이종이식편을 가진 마우스의 꼬리 정맥에 방사선 리간드를 주입합니다. 주입할 활성량은 연구자에 의해 결정됩니다. 발표된 데이터에 따르면 종양 크기에 대한 용량 의존적 치료 효과는 7.4 - 55.5MBq 범위 내에서 나타났습니다.
