순환 miRNA 추출: 유기 추출 및 Small RNA 농축을 통해 혈장 샘플에서 miRNA를 분리하는 방법

Abstract

출처: Canale, M. et al., 전이성 대장암 환자에서 순환 MicroRNA 맞춤형 패널 검출. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 유기 추출과 유리 섬유 컬럼 농축을 사용하여 대장암 환자의 혈장 샘플에서 순환 microRNA를 추출하는 방법을 설명합니다. miRNA는 혈청 및 혈장과 같은 생물학적 유체에서 안정적이므로 암 진단, 예후, 치료 의사 결정 및 모니터링을 위한 이상적인 순환 바이오마커입니다. 이 방법은 환자의 임상 결과를 예측할 수 있는 새로운 순환 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

Protocol

참고: GLP(Good Laboratory Practice)에 따라 멸균된 흄 후드 아래에서 다음 단계를 모두 수행하십시오.

1. 플라즈마 수집 및 저장

1. K3E EDTA 튜브에 말초 혈액 샘플 3mL를 수집합니다.
2. 튜브를 1,880 x g의 실온에서 15분 동안 원심분리합니다.
3. 450 μL의 분취액에서 상층 혈장을 회수합니다.
4. 샘플을 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
   참고: 채취 후 2시간 이내에 말초 혈액 튜브를 처리하십시오. 튜브에서 혈장을 회수할 때 림프구층을 방해하지 마십시오.

2. 혈장 샘플에서 순환 miRNA 추출

1. 필요한 모든 용액을 준비하고 추출 단계를 위해 샘플을 해동합니다.
   1. 2x 변성 용액에 375μL의 2-메르캅토에탄올을 첨가하고 잘 혼합합니다.
   2. miRNA 세척 용액 I에 ACS 등급 100% 에탄올 21mL를 넣고 잘 섞습니다.
   3. 세척액 40/3에 ACS 등급 100% 에탄올 20mL를 넣고 잘 섞습니다.
   4. 혈장 부분 표본을 실온에서 해동시킨 다음 추출 단계를 시작합니다.

2. 유기 추출
   1. 혈장 시료 400μL를 RNase가 없는 2mL 튜브로 옮깁니다.
   2. 400 μL의 2x 변성 용액을 첨가하고 볼텍싱으로 혼합하여 간단히 원심분리합니다.
   3. 4μL의 1nM 스파이크인을 추가하고 볼텍싱으로 혼합하고 간단히 원심분리합니다.
   4. 800μL의 산 페놀-클로로포름을 추가합니다.
   5. 60초 동안 볼텍스, 15분 동안 최대 속도(≥10,000 x g)로 원심분리기.
   6. 상부 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. 병기를 방해하지 마십시오. 회복된 부피를 기록하고 비수성 phase.
      가 포함된 튜브를 폐기합니다. 메모: 2x 변성 용액은 4°C에서 보관되며 이 온도에서 응고될 수 있습니다. 사용하기 전에 용액을 37 °C로 가열하고 때때로 10-15 분 동안 교반하십시오. 혼합물 위에 있는 수성 완충액이 아닌 산 페놀-클로로포름을 포함하는 바닥 상을 회수하도록 주의하십시오. 용출 용액 또는 뉴클레아제가 없는 물을 95°C로 예열합니다.적절한 양의 용액(샘플당 100μL + 10% 초과)을 가열하도록 주의하십시오.

1. 작은 RNA 농축
   1. 단계 2.2.6의 수성상에 1/3부피의 에탄올 100%를 첨가하고 잘 혼합합니다.
   2. 각 샘플에 대해 필터 카트리지를 새 수집 튜브에 넣습니다.
   3. 2.3.1단계에서 최대 700μL의 용해물과 에탄올을 필터 카트리지로 옮기고 10,000 x g에서 30초 동안 원심분리합니다.
   4. 혼합물이 >700μL가 남아 있으면 여과액을 새 튜브에 넣고 2.3.3단계를 반복합니다. 전체 혼합물이 필터 카트리지를 통과할 때까지 반복합니다.
   5. 플로우 스루의 총 부피를 측정합니다.
   6. 에탄올 2/3 부피를 100% 여과하여 여과하고 철저히 혼합합니다.
   7. 새 수집 튜브에 두 번째 필터 카트리지를 넣습니다.
   8. 최대 700μL의 시료를 카트리지로 옮기고 10,000 x g에서 30초 동안 원심분리합니다.
   9. 모든 혼합물이 필터 카트리지를 통과할 때까지 1.3.8단계를 반복합니다.
   10. 700μL의 miRNA 세척 용액 1을 필터 카트리지에 바르고 10,000 x g에서 15초 동안 수집 튜브로 필터 카트리지를 원심분리합니다. 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
   11. 필터 카트리지에 세척 용액 2/3 500μL를 바르고 10,000 x g에서 15초 동안 수집 튜브로 필터 카트리지를 원심분리합니다. 필터 카트리지를 새 수집 튜브에 넣습니다.
   12. 필터 카트리지를 새 수집 튜브에 넣고 500μL의 세척 용액 2.3.11로 2/3단계를 반복합니다. 플로우 스루를 버리고 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮깁니다.
   13. 필터 카트리지가 있는 튜브를 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
   14. 필터 카트리지를 새 1.5mL 수집 튜브에 넣고 100μL의 예열된(95°C) 용출 용액 또는 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다.
   15. 10,000 x g에서 30초 동안 원심분리기를 사용하여 miRNA를 회수하고 -80°C에서 보관합니다.
       메모: 세척 용액 2/3에 흰색 침전물이 형성될 수 있습니다. 이 침전물은 용액에서 방출되는 과량의 EDTA입니다. 피펫팅 단계에서 이러한 결정을 끌어올리지 마십시오.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNASE-free Safe-lock 1.5 mL 튜브	에펜도르프	0030 123.328
RNAase가 없는 1000 μL 팁	스타랩	S1122-1830
RNAase-free Safe-lock 2 mL 튜브	에펜도르프	0030 123.344
RNAase가 없는 20 μL 팁	스타랩	S1123-1810
RNAase가 없는 200μL 팁	스타랩	S1120-8810
mirVana PARIS RNA 및 네이티브 단백질 정제 키트	써모 피셔	AM1556
100% 에탄올 anidrous ACS 급료	Carlo Erba 시약	414605
2-메르캅토-에탄올	시그마-알드리치	M3148
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 μL 실험실용 피펫
흄 후드
탁상형 마이크로 원심분리기
소용돌이