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동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 대변에서 게놈 DNA 분리
참고: 대변 병원체 검출 프로토콜에 따라 대변에서 미생물 DNA를 분리하기 위해 상용 키트를 활용하십시오. -80 °C 냉동고에서 샘플을 직접 꺼내 칭량하는 동안 드라이아이스에 보관하십시오.
- 최대 220mg의 대변을 1.4mL의 실온(RT) 대변 용해 버퍼가 들어 있는 깨끗한 마이크로분리 튜브로 옮깁니다(재료 표 참조).
- 고체를 완전히 균질화하기 위해 1분 동안 와류 샘플(그림 1B). 현탁액을 95°C로 5분 동안 가열하여 모든 박테리아(그람 양성 박테리아 포함)를 용해시킵니다.
- Vortex는 15초 동안 샘플링한 다음 20,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 대변 고형물을 펠릿화합니다. 상층액을 2mL 마이크로분리관으로 옮깁니다. 각 샘플에 하나의 정제를 추가하여 PCR 억제제를 흡수하고 정제가 용해될 때까지 와류를 일으키고 RT에서 1분 동안 샘플을 배양합니다.
- 20,000 x g에서 3분 동안 시료를 원심분리하고 상층액을 새 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 20,000 x g에서 3분 동안 원심분리기 15μL의 proteinase K(20mg/mL stock)를 새로운 1.5mL 마이크로분리 튜브에 분취합니다. 시료 200μL를 proteinase K가 들어 있는 튜브에 피펫팅합니다.
- 200μL의 guanidinium chloride lysis buffer를 튜브에 추가하고 15초 동안 철저히 와류(재료 표 참조)하고 70°C에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.튜브에 200μL의 에탄올(96-100%)을 추가하고 볼텍싱으로 잘 혼합합니다.
- 실리카 기반 스핀 컬럼을 2mL 수집 튜브에 넣고 샘플을 컬럼에 적용합니다. 뚜껑을 닫고 20,000 x g에서 1분 동안 원심분리기를 합니다.
- 컬럼을 새 2mL 수집 튜브로 옮기고 500μL의 세척 버퍼 1을 컬럼에 추가하고, 20,000 x g에서 1분 동안 컬럼과 원심분리를 합니다.컬럼을 새 2mL 수집 튜브로 옮기고 500μL의 세척 버퍼 2를 컬럼에 추가합니다. 캡을 닫고 20,000 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 캡을 닫은 상태에서 컬럼을 새 2mL 수집 튜브로 옮기고 20,000 x g에서 추가로 1분 동안 원심분리하여 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. 컬럼을 1.5mL 표지된 마이크로분리 튜브로 옮기고 EDTA가 포함된 200μL의 용리 완충액을 멤브레인에 추가하여 샘플을 용리합니다(재료 표 참조).
- 캡을 닫고 상온에서 1분 동안 배양합니다. 20,000 x g에서 1분 동안 샘플을 원심분리하고 컬럼을 버립니다.
2. PCR를 위한 DNA 농도 측정 그리고 표본 준비
참고: 형광측정기와 시중에서 판매되는 dsDNA 형광 분석을 사용하여 각 샘플의 게놈 DNA 농도를 측정합니다(재료 표 참조). 형광 염료는 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합해야 합니다.
- 각 샘플의 1:200 희석(199 μL dsDNA 마스터 믹스에서 각 샘플의 1 μL)과 표준물질의 1:50 희석을 준비합니다. dsDNA 설정을 사용하여 형광계에서 분석합니다.
주: PCR에 있는 DNA의 대량은 억제일 수 있습니다, 그러므로, 이용된 DNA의 양은 PCR의 마지막 양의 10%를 넘지 않아야 합니다. 형광 염료에 결합된 DNA만 형광을 발하여 최종적으로 계산된 DNA 농도에 오염 물질이 기여할 가능성을 제거하기 때문에 형광측정기를 사용하면 샘플의 DNA를 정확하게 측정할 수 있습니다. 이러한 수준의 정확한 정량 분석은 다운스트림 염기서열분석 응용 분야에 필수적입니다.
- 10mM Tris, pH 8.5의 적절한 부피로 5ng/μL로 희석된 PCR 템플릿을 준비하여 각 샘플의 작업 템플릿 스톡을 만듭니다.
- -20 °C에서 샘플을 보관하십시오.
3. 16S 원하는 V 영역에 대한 입문서 설계
- 원하는 V 16S rRNA 영역을 선택적으로 증폭할 수 있도록 프라이머를 설계합니다.
- Ribosomal Database Project의 Probe Match로 프라이머를 분석하여 다양한 phyla.
에 대한 대략적인 적중률을 결정합니다.
참고: V1-V3 영역의 경우, 현재 연구에서는 V1 영역 내의 위치 8에서 결합하는 발표된 프라이머 Bosshard forward와 V3 영역 내의 위치 533에서 결합하는 533 reverse를 사용했습니다. Primers는 인덱싱을 위한 오버행 어댑터 시퀀스를 포함해야 합니다.
- 프라이머를 설계할 때 16S 균유전체학 염기서열분석 라이브러리 준비에 권장되는 대로 각 프라이머의 5' 말단에 어댑터 염기서열을 포함하십시오(표 1).
- 이 대형 프라이머를 카트리지 정제와 합성합니다. 건조된 프라이머를 재구성하고 PCR 작업 원료를 10mM Tris, pH 8.5에서 1μM로 희석합니다.
4. 오버행 어댑터 서열이 부착된 V 영역을 증폭하는 Amplicon PCR
- 표 2에 설명된 대로 앰플리콘 PCR 반응 혼합물을 설정합니다.
- 플레이트에 투명 접착 PCR 플레이트 씰을 놓고 표 3의 파라미터를 사용하여 앰플리콘 PCR을 실행합니다.
- (선택 사항) 앰플리콘 크기의 정량적 측정이 가능한 아가로스 겔 또는 고감도 DNA 어세이에서 앰플리콘 PCR 산물을 실행합니다(재료 표 참조).
참고: 이 연구의 앰플리콘 크기는 550bp입니다(그림 2a).
5. 마그네틱 비드를 사용한 PCR 정제
- 앰플리콘 PCR 플레이트를 1,000 x g에서 1분 동안 빠르게 원심분리하여 응축을 수집합니다.
메모: 오염을 최소화하기 위해 PCR 플레이트 대신 PCR 튜브 스트립을 사용할 수 있습니다. 튜브 뚜껑은 버리고 절대 재사용하지 마십시오.
- 마그네틱 비드를 볼텍스하여 고르게 분산시키고 각 앰플리콘 PCR 웰에 20μL의 마그네틱 비드를 첨가한 다음 전체 부피를 천천히 10회 위아래로 피펫팅합니다.
- RT에서 5분 동안 배양합니다.PCR 플레이트를 마그네틱 비드가 수집되고 상층액이 투명해질 때까지 2분 동안 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 상층액을 제거하고 폐기합니다.
- PCR 플레이트가 마그네틱 스탠드에 있는 동안 200μL의 신선한 80% 에탄올로 비드를 세척하고 마그네틱 스탠드에서 RT로 30초 동안 배양합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
- 두 번째로 세탁을 반복합니다. 이제 미세한 피펫 팁을 사용하여 웰에서 잔류 에탄올을 제거하고 10분 동안 공기 건조시킵니다.
- 마그네틱 스탠드에서 PCR 플레이트를 제거하고 각 웰에 52.5μL의 10mM Tris pH 8.5를 추가합니다. 피펫을 위아래로 10회 반복하여 비드를 매달고 실온에서 2분 동안 배양합니다.
- PCR 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮겨 마그네틱 비드를 수집하고 상층액 50μL를 깨끗한 PCR 플레이트로 옮깁니다. 플레이트에 투명 PCR 플레이트 씰을 접착하고 -20°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
| 앰플리콘 PCR 프라이머 |
| 전달 | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG아가트가트cMtggctcag-3' |
| 후진 | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| 궤적 특정 시퀀스는 굵게 표시되고 굵게 표시되지 않은 시퀀스는 오버행 어댑터 시퀀스입니다. |
표 1: 앰플리콘 PCR 프라이머.
| Amplicon PCR 반응 설정 | |
| 음량 |
| 미생물 DNA(5ng/μl) | 2.5 μL |
| 포워드 프라이머(1μM, 3.1단계부터) | 5.0 μL |
| 리버스 프라이머(1μM, 3.1단계부터) | 5.0 μL |
| 2X 핫스타트 레디 믹스 | 12.5 μl |
| 합계 | 25.0 μL |
표 2: 앰플리콘 PCR 프라이머.
| Amplicon PCR 설정 |
| 95 분 동안 3 °C | |
| 25 사이클 : | |
| 95초 동안 30°C |
| 30초 동안 55°C |
| 72 ° C 60 초 동안 |
| 72 °C에서 3 분 동안 | |
| 4 °C에서 유지 | |
표 3: Amplicon PCR 프로그램 설정.
