CRC 오가노이드 세포 라벨링: GFP 렌티바이러스 형질도입 대장암 오가노이드 세포를 생성하는 방법

초록

출처: Okazawa Y. et al., High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transducted Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. 특급. (2018).

이 동영상은 형광 이미징을 가능하게 하기 위해 GFP 렌티바이러스 입자에 의해 형질전환된 CRC 오가노이드를 생성하는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 GFP 표지 오가노이드는 동물 모델에 배치될 때 종양 침입 및 전이를 연구하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 인공 세포외 기질에서 배양된 CRC 오가노이드 생성

결장 PDX의 CRC 오가노이드 배양에 대한 실험 절차는 그림 1B(4단계)에 요약되어 있습니다.

1. 인간 결장 오가노이드에 대해 이전에 기술된 배지를 사용하여 PDX 유래 CRC 오가노이드(Table of Materials, "CRC 오가노이드 배양 배지" 참조)에 적합한 배양 배지를 구축합니다.
2. 얼음 위의 12웰 플레이트에 웰당 150μL의 인공 세포외 기질(재료 표 참조)을 적용한 다음 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 30-60분 동안 배양하여 겔을 응고시킵니다.
3. PDX 마우스 모델에서 얻은 CRC 세포의 세포 펠릿을 CRC 오가노이드 배양 배지(단계 1.1)와 함께 5% FCS로 현탁시켜 3 x 10⁵ cells/mL로 조정합니다. 그런 다음 1.2단계에서 준비한 인공 세포외 기질 코팅 플레이트에 배지 1mL를 시드하고 5%_CO2 이하에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액에 있는 단일 세포 및 다세포 클러스터(부착 세포 그룹)를 포함한 종양 세포의 수를 계산합니다.
   참고: 이 연구에서는 콜라겐분해효소의 잔류 효소 활성을 억제하기 위해 5% FCS가 사용됩니다.
4. 다음 날 인공 세포외 기질로 코팅된 플레이트에서 분리된 부유 세포를 포함한 배양 배지를 1.5mL 원심분리 튜브에 조심스럽게 수집하고 1,400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 펠릿을 얼음 위의 인공 세포외 기질 70μL에 재현탁합니다.
5. CRC 세포 생존력을 높이기 위해 인공 세포외 기질이 코팅된 플레이트에 부착된 종양 오가노이드 세포에 종양 세포를 함유한 인공 세포외 기질을 오버레이하고 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 30분 동안 배양하여 인공 세포외 기질 코팅을 응고시킵니다. 그런 다음 5%_CO2 미만에서 37°C에서 1% FCS가 있는 CRC 오가노이드 세포 배양 배지 1mL와 함께 배양합니다.
6. 이틀에 한 번씩 배양 매체를 교체하십시오. CRC 오가노이드가 배지를 채우면 배지를 매일 교체해야 할 수도 있습니다.

2. GFP 렌티바이러스 입자의 생성 및 농축

GFP 렌티바이러스 입자의 생성 및 농축을 위한 실험 절차는 그림 1C(5단계)에 설명되어 있습니다.

1. 10% FCS를 함유한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지로 세포를 HEK293T 배양하고 다음 형질주입 절차를 위해 10cm 접시 6개(접시당 2 x 10,^{세포 6}개)를 준비합니다.
2. 접시당 transfection을 위해 PRRL-GFP 벡터(5μg) 및 pCMV-VSV-G(1μg) 및 pCMV-dR8.2 dvpr(5μg)과 같은 2개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드와 함께 DMEM에 20μL의 transfection 시약을 포함한 혼합물 500μL를 멸균 1.5mL 마이크로튜브에 준비합니다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 보관한 다음 각 10cm 접시에 오버레이하고 18시간 동안 배양합니다.
3. 매체를 제거하고 각 접시에 신선한 10% FCS-RPMI 1640 배지 5mL를 넣고 24시간 동안 그대로 둡니다.
4. 각 접시에서 컨디셔닝된 배지를 50mL 원심분리 튜브에 모으고 총 30mL의 배지를 4°C에서 밤새 보관합니다. 각 접시에 신선한 RPMI 1640 5mL를 넣고 24시간 동안 그대로 둡니다.
5. 각 접시의 컨디셔닝된 배지를 50mL 원심분리 튜브에 넣고 총 30mL의 배지를 얼음에 보관합니다. 그런 다음 셀을 버립니다.
6. 0.45μm 필터를 통해 배지 60mL(단계 2.4-2.5)를 여과하여 세포를 제거하고 이 양을 초원심분리를 위해 12개의 5mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 나눕니다.
7. 바이러스를 농축하려면 85,327 x g의 스윙 버킷 로터를 사용하여 4°C에서 1.5시간 동안 원심분리합니다.
8. 즉시 매체를 제거하십시오. 농축된 바이러스 펠릿을 분해하기 위해 12개의 튜브 각각에 FCS가 없는 Nutrient Ham's Mixture F-12 (F12)/DMEM medium을 250μL씩 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 유지합니다. 바이러스 알갱이는 종종 보이지 않습니다.
9. 배지를 부드럽게 피펫팅하여 농축된 5x GFP 렌티바이러스 스톡의 3mL를 수집하며, 총 10⁸ transducing units per mL(TU/mL)를 갖는 GFP 렌티바이러스 입자를 포함하는 것으로 추정됩니다. 그런 다음 12개의 1.5mL 마이크로튜브(튜브당 250μL 포함)를 -80°C의 멸균 조건에서 최대 1년 동안 보관합니다. 여러 번의 동결-해동 주기를 피하기 위해 원래 용액의 작은 부분 표본을 많이 준비합니다.

3. 인공 세포외 기질에서 배양된 GFP 렌티바이러스 입자를 사용한 CRC 오가노이드 세포의 라벨링

GFP 렌티바이러스로 CRC 오가노이드 세포를 라벨링하는 실험 절차는 그림 1C(6단계)에 요약되어 있습니다.

1. 1.6단계에서 준비한 CRC 오가노이드를 7-10일 동안 간섭 없이 성장시킨 후 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 기계적으로 수확한 후 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
   메모: 배양에서 CRC 오가노이드의 성장은 환자의 원래 종양의 특성에 따라 달라집니다. CRC 오가노이드를 60-70% 합류 비율로 유지한 후 1:2 분할 비율로 새로운 인공 세포외 기질로 코팅된 12웰 플레이트로 옮겨 CRC 오가노이드의 과증식을 방지합니다.
2. 마이크로튜브를 1,400 x g에서 3분 동안 원심분리하고, 배양 배지를 제거한 후 부드럽게 두드려 500μL PBS에서 세포 펠릿을 분해합니다.
3. 마이크로튜브를 1,400 x g에서 3분 동안 원심분리하고 PBS를 제거합니다.
4. 부착된 CRC 오가노이드를 해리하려면 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소의 세포 분리 용액 500μL를 튜브의 세포 펠릿에 넣고 부드럽게 두드려 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 10분 동안 가라앉히도록 둡니다.
5. 1.5mL 마이크로튜브에 500μL의 1% FCS-DMEM을 추가로 500μL씩 여러 차례 매우 부드럽게 피펫팅하여 세포를 대략적으로 해리합니다. 가혹한 피펫팅에 의한 CRC 오가노이드에서 단일 세포를 생성하면 세포 생존율이 현저히 감소합니다. 따라서 1.5mL 마이크로튜브를 부드럽게 피펫팅하여 세포 현탁액에서 세포 덩어리를 육안으로 감지할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
6. 1,400 x g에서 3분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
7. 1.5mL 마이크로튜브에 100μL의 5x GFP 렌티바이러스 스톡(>10⁸ TU/mL)과 400 μL의 CRC 오가노이드 배양 배지의 혼합물로 세포 펠릿을 분해하여 500 μL당 5 x 10⁵ 해리된 종양 세포의 농도로 조정합니다.혈구계를 사용하여 종양 세포의 수를 계산합니다. 상기된 바와 같이 세포 현탁액에 단일 세포 및 세포 그룹을 포함한다(단계 1.3).
8. 1.2단계에서 설명한 대로 인공 세포외 기질로 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음, 단계 3.7에서 제조된 세포 현탁액 500μL를 플레이트에 놓고 5%_CO2 이하에서 37°C에서 18시간 동안 그대로 둡니다.
9. 인공 세포외 기질이 코팅된 플레이트에서 분리된 부유 세포가 있는 배지를 1.5mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 1,400 x g에서 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 펠릿을 얼음 위의 인공 세포외 기질 70μL에 다시 현탁시킵니다.
10. CRC 세포 생존율을 높이려면 1.5단계에서 설명한 대로 종양 세포외 기질로 코팅된 12웰 플레이트에 부착된 종양 오가노이드에 종양 세포를 포함하는 인공 세포외 기질을 오버레이합니다. 다음으로, 플레이트를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에서 30분 동안 배양하여 인공 세포외 기질 코팅을 응고시킨 다음 5%_CO2 미만에서 37°C에서 1% FCS가 있는 CRC 오가노이드 배양 배지 1mL로 배양합니다.
11. 감염 후 3일 후에 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 높은 렌티바이러스 입자 역가를 사용하여 거의 100% GFP 양성을 확인합니다(그림 2A 참조).
12. 수용 마우스에 주입하기 전에 세포 성장을 확장하기 위해 CRC 오가노이드를 7-10일 동안 배양합니다.

결과

그림 1: NOG 마우스에서 GFP 렌티바이러스로 표지된 PDX 유래 CRC 오가노이드에 의한 전이 발생의 개략도. (A) CRC 조직의 작은 조각을 NOG 마우스에 피하 이식(1단계). 환자로부터 외과적으로 절개한 CRC 조직을 조각으로 절단하여 NOG 마우스에 피하 이식했습니다. S.C.: 피하 이식.(B) PDX에서 해리된 CRC 오가노이드 생성(2-4단계). 개발된 CRC 이종이식편을 다지고(2단계) 콜라겐분해효소를 포함한 배양 배지를 함유한 15mL 튜브로 옮겼습니다(3단계). 느린 교반으로 배양한 후, CRC 세포 현탁액을 여과하였다(단계 3). 그런 다음, CRC 오가노이드 배지의 오가노이드 세포 현탁액을 인공 세포외...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12웰 플레이트	BMBio	#92412
마이크로튜브	에펜도르프	#0030120086	사용 전 오토클레이브
혈구계	Erma	#03-202-1
Matrigel 기저막 매트릭스	코닝	#354234	-20°C에서 저장하십시오. 사용할 때까지 얼음 위에 올려 놓으십시오.
콜라겐 분해 효소 유형 1	시그마	#C1030	150 mg/ml 콜라겐 분해 효소 1 in 1× PBS입니다. 부분 표본을 -20°C에 저장하십시오. C 최대 1년
DMEM/F-12 with GlutaMAX™	깁코	#10565018
페니실린	Gibco	#15140122	4°C에 보관. 1개월 이내 사용
hEGF	페프로텍	#AF-100-15	-20°C에서 보관하십시오. ROCK 억제제인
Y27632를 사용하는 것과 같은 날에 배지에 추가합니다.	와코	#253-00591	-20°C에 보관. 사용 당일에 매체에 추가
스트렙토마이신	Gibco	#15140122	4°C에 보관. 1개월 이내 사용
1% 또는 5% FCS			DMEM/F-12 with GlutaMAX™ 보충제 (Gibco # 10565018) 1 % 또는 5 % FCS, 100 U / ml 페니실린, 100 µ g/ml 스트렙토마이신, 2 ng/ml hEGF 및 10 &마이크로; M Y27632, ROCK 억제제. 4°C에 보관하십시오. 1개월 이내에 사용하십시오.
PRRL-GFP 벡터	로버트 A. 와인버그 박사의 선물
FuGENE 6 transfection regent	로슈	11814 443001
pCMV-VSV-G	로버트 A. 와인버그 박사의 선물
pCMV-dR8.2 dvpr	로버트 A. 와인버그(Robert A. Weinberg) 박사의 선물
Zeiss Axioplan 2 실체 형광 현미경	자이스