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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 마우스에서 CRC PDX 해부
CRC PDX의 해부를 위한 실험 절차는 그림 1B(2단계)에 요약되어 있습니다.
- 종양이 피하에서 ~1cm3 크기로 자랄 때까지 기다리며, 이는 보통 약 1-3개월이 소요됩니다.
- 소동물 흡입 마취 장치를 사용하여 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취하고 70% 에탄올로 피부를 소독합니다.
- 마우스를 실험실 벤치에 엎드린 자세로 놓습니다. 피부를 절개하고 종양을 노출시킨 다음 멸균 가위를 사용하여 종양에서 피부를 조심스럽게 분리합니다. 종양을 제거한 후 10cm 페트리 접시에 놓고 종양에서 심하게 괴사된 부위를 제거한 다음 PBS 5mL로 두 번 헹굽니다.
메모: 괴사 부위는 종종 주변 부위보다 더 하얗고 부드러우며 부서지기 쉽습니다.
- 종양을 얼음 위에 놓고 1) CRC 오가노이드 배양, 2) 2차 마우스에 이식, 3) 조직학적 검사, 4) 종양 조각의 동결 및 보관을 포함한 다양한 응용 분야에 대해 종양을 최소 4개 부분으로 균등하게 나눕니다.
- CRC 오가노이드를 생성하기 위해 1mL의 멸균 PBS가 들어 있는 6cm 페트리 접시에 고형 종양 조직을 놓습니다. 처리할 때까지 조직을 얼음 위에 보관하십시오.
- 인간 CRC에 대한 PDX 모델을 확립하려면 새로운 CRC PDX를 보조 마우스에 통과시킵니다. 멸균 면도날을 사용하여 종양 조직을 작은 조각(5 x 5 x 5mm,3인치 크기)으로 자르고 이 조직 조각을 50μL의 인공 세포외 기질에 부드럽게 담그십시오. 그런 다음 이 조각을 NOG 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 피하 주머니의 아래쪽 부분에 이식합니다.
- 마취된 마우스를 실험실 벤치에 엎드린 자세로 놓습니다. 수혜자 마우스의 오른쪽과 왼쪽 옆구리의 아래쪽 부분을 작게 절개하여 멸균 가위를 사용하여 조직 이식을 위한 피하 주머니를 생성합니다. 복막에 구멍을 뚫지 않도록 주의하세요. 이 절차로 출혈이 거의 없어야 합니다.
- 위에서 준비한 종양 조각을 50μL의 인공 세포외 기질에 부드럽게 담근 다음 좌우 피하 주머니의 하부에 이식합니다.
- 수술을 받는 마우스에서 상처 클립으로 절개 부위를 봉합합니다. 이식된 종양 조직이 피부 아래 절개 부위에서 약간 떨어진 곳에 있는지 확인하십시오.
메모: 수술 절차를 최소화하기 위해 본 연구에서는 수술 후 통증 및 감염에 대한 치료법을 시행하지 않았다.
- 마우스를 따뜻한 패드에 놓고 충분한 의식이 회복될 때까지 흉골 누운 자세를 유지합니다. 완전히 회복되어 네 다리로 일어설 수 있게 되면, 쥐는 집에 있는 우리로 돌아갈 수 있습니다. 포식을 방지하기 위해 같은 케이지에서 작동하지 않는 동물과 교배하는 것을 허용하지 마십시오.
- 조직학적 분석을 위해 10% 중성 완충 포르말린 5mL에 있는 샘플을 15mL 원뿔형 튜브에 넣고 실온에서 2일 동안 고정합니다.
- 동결 보존을 위해 종양 조직을 작은 조각(5 x 5 x 5 mm,3인치 크기)으로 자르고 샘플을 1-1.5mL 극저온 튜브의 500μL의 세포 동결 용액에 부드럽게 담그십시오. 그런 다음 튜브를 -80°C 냉동고로 옮깁니다.
2. CRC 오가노이드 배양을 위한 세포 현탁액으로 PDX 추출
CRC PDX의 해리를 위한 실험 절차는 그림 1B(3단계)에 요약되어 있습니다.
- 위(1.4.1단계)에서 준비된 종양 조각을 10cm 페트리 접시에 놓습니다.
- 멸균 면도날을 사용하여 단편을 다진 후 80μL의 콜라겐분해효소 스톡이 있는 10% 태아 송아지 혈청(FCS)-Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 8mL가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다(재료 표 참조).
- 튜브를 단단히 닫고 파라필름으로 캡을 감싸 누출을 방지합니다. 다진 종양 조각을 세포 현탁액으로 해리하려면 37°C에서 2시간 동안 부드럽게 교반합니다. 튜브에는 여전히 소화되지 않은 조직 조각이 많이 남아 있습니다.
- 300 x g에서 튜브를 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 10mL의 10% FCS-DMEM을 사용하여 세포 펠릿을 분해하여 세포 현탁액을 만듭니다.
- 소화되지 않은 조직 파편을 제거하려면 50mL 코니컬 튜브에 설정된 40μm 세포 여과기를 사용하여 세포 현탁액을 두 번 여과합니다. 그런 다음 300 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 플로우 스루를 원심 분리합니다.상등액을 제거하고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
3. 인공 세포외 기질에서 배양된 CRC 오가노이드 생성
결장 PDX의 CRC 오가노이드 배양에 대한 실험 절차는 그림 1B(4단계)에 요약되어 있습니다.
- 인간 결장 오가노이드에 대해 이전에 기술된 배지를 사용하여 PDX 유래 CRC 오가노이드(Table of Materials, "CRC 오가노이드 배양 배지" 참조)에 적합한 배양 배지를 구축합니다.
- 얼음 위의 12웰 플레이트에 웰당 150μL의 인공 세포외 기질(재료 표 참조)을 적용한 다음 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 30-60분 동안 배양하여 겔을 응고시킵니다.
- CRC 오가노이드 배양 배지(3.1단계)를 사용하여 2.5단계의 세포 펠렛을 5% FCS로 현탁하여 3 x 105 cells/mL로 조정합니다. 그런 다음 3.2단계에서 준비한 인공 세포외 기질 코팅 플레이트에 배지 1mL를 시딩합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 이하로 밤새 배양하십시오. 혈구계를 사용하여 세포 현탁액에 있는 단일 세포 및 다세포 클러스터(부착 세포 그룹)를 포함한 종양 세포의 수를 계산합니다.
참고: 이 연구에서는 콜라겐분해효소의 잔류 효소 활성을 억제하기 위해 5% FCS가 사용됩니다.
- 다음 날 인공 세포외 기질로 코팅된 플레이트에서 분리된 부유 세포를 포함한 배양 배지를 1.5mL 원심분리 튜브에 조심스럽게 수집하고 1,400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 펠릿을 얼음 위의 인공 세포외 기질 70μl에 재현탁합니다.
- CRC 세포 생존력을 높이기 위해 인공 세포외 기질이 코팅된 플레이트에 부착된 종양 오가노이드 세포에 종양 세포를 함유한 인공 세포외 기질을 오버레이하고 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 30분 동안 배양하여 인공 세포외 기질 코팅을 응고시킵니다. 그런 다음 5%CO2 미만에서 37°C에서 1% FCS가 있는 CRC 오가노이드 세포 배양 배지 1mL와 함께 배양합니다.
- 이틀에 한 번씩 배양 매체를 교체하십시오. CRC 오가노이드가 배지를 채우면 배지를 매일 교체해야 할 수도 있습니다.
4. GFP 렌티바이러스 입자의 생성 및 농축
GFP 렌티바이러스 입자의 생성 및 농축을 위한 실험 절차는 그림 1C(5단계)에 설명되어 있습니다.
- 10% FCS를 함유한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지로 세포를 HEK293T 배양하고 다음 형질주입 절차를 위해 10cm 접시 6개(접시당 2 x 10,세포 6개)를 준비합니다.
- 접시당 transfection을 위해 PRRL-GFP 벡터(5μg)12 및 pCMV-VSV-G(1μg) 및 pCMV-dR8.2 dvpr(5μg)과 같은 2개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드와 함께 DMEM에 20μl의 transfection 시약을 포함한 혼합물 500μL를 멸균 1.5mL 마이크로튜브에 준비합니다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 보관한 다음 각 10cm 접시에 오버레이하고 18시간 동안 배양합니다.
- 매체를 제거하고 각 접시에 신선한 10% FCS-RPMI 1640 배지 5mL를 넣고 24시간 동안 그대로 둡니다.
- 각 접시에서 컨디셔닝된 배지를 50mL 원심분리 튜브에 모으고 총 30mL의 배지를 4°C에서 밤새 보관합니다. 각 접시에 신선한 RPMI 1640 5ml를 넣고 24시간 동안 그대로 둡니다.
- 각 접시의 컨디셔닝된 배지를 50mL 원심분리 튜브에 넣고 총 30mL의 배지를 얼음에 보관합니다. 그런 다음 셀을 버립니다.
- 0.45μm 필터를 통해 배지 60mL(단계 4.4-4.5)를 필터링하여 세포를 제거하고 이 양을 초원심분리를 위해 12개의 5mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 나눕니다.
- 바이러스를 농축하려면 85,327 x g에서 4°C에서 1.5시간 동안 스윙 버킷 로터(재료 표 참조)를 사용하여 원심분리합니다.
- 즉시 매체를 제거하십시오. 농축된 바이러스 펠릿을 분해하기 위해 12개의 튜브 각각에 FCS가 없는 Nutrient Ham's Mixture F-12 (F12)/DMEM medium을 250μL씩 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 유지합니다. 바이러스 알갱이는 종종 보이지 않습니다.
- 배지를 부드럽게 피펫팅하여 농축된 5x GFP 렌티바이러스 스톡의 3mL를 수집하며, 총 108 transducing units per mL(TU/mL)를 갖는 GFP 렌티바이러스 입자를 포함하는 것으로 추정됩니다. 그런 다음 12개의 1.5mL 마이크로튜브(튜브당 250μL 포함)를 -80°C의 멸균 조건에서 최대 1년 동안 보관합니다. 여러 번의 동결-해동 주기를 피하기 위해 원래 용액의 작은 부분 표본을 많이 준비합니다.
5. 인공 세포외 기질에서 배양된 GFP 렌티바이러스 입자를 사용한 CRC 오가노이드 세포의 라벨링
GFP 렌티바이러스로 CRC 오가노이드 세포를 라벨링하는 실험 절차는 그림 1C(6단계)에 요약되어 있습니다.
- 3.6단계에서 제조한 CRC 오가노이드를 7-10일 동안 간섭 없이 성장시킨 후 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 기계적으로 수확한 다음 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
메모: 배양에서 CRC 오가노이드의 성장은 환자의 원래 종양의 특성에 따라 달라집니다. CRC 오가노이드를 60-70% 합류 비율로 유지한 후 1:2 분할 비율로 새로운 인공 세포외 기질로 코팅된 12웰 플레이트로 옮겨 CRC 오가노이드의 과증식을 방지합니다.
- 마이크로튜브를 1,400 x g에서 3분 동안 원심분리하고, 배양 배지를 제거한 후 부드럽게 두드려 500μL PBS에서 세포 펠릿을 분해합니다.
- 마이크로튜브를 1,400 x g에서 3분 동안 원심분리하고 PBS를 제거합니다.
- 부착된 CRC 오가노이드를 해리하려면 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소의 세포 분리 용액 500μL를 튜브의 세포 펠릿에 넣고 부드럽게 두드려 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 10분 동안 가라앉히도록 둡니다.
- 1.5mL 마이크로튜브에 500μL의 1% FCS-DMEM을 추가로 500μL씩 여러 차례 매우 부드럽게 피펫팅하여 세포를 대략적으로 해리합니다. 가혹한 피펫팅에 의한 CRC 오가노이드에서 단일 세포를 생성하면 세포 생존율이 현저히 감소합니다. 따라서 1.5mL 마이크로튜브를 부드럽게 피펫팅하여 세포 현탁액에서 세포 덩어리를 육안으로 감지할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
- 1,400 x g에서 3분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
- 100 μL의 5x GFP 렌티바이러스 스톡(>108 TU/mL)과 400 μl의 CRC 오가노이드 배양 배지의 혼합물로 세포 펠릿을 1.5 mL 마이크로튜브에 넣고 500 μl당 5 x 105 해리 종양 세포의 농도로 조정합니다.종양 세포의 수를 계산하기 위해 혈구계를 사용합니다. 상기된 바와 같이 세포 현탁액에 단일 세포 및 세포 그룹을 포함한다(단계 3.3).
- 3.2단계에서 설명한 대로 인공 세포외 기질로 코팅된 12웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음, 단계 5.7에서 제조된 세포 현탁액 500 μl를 플레이트에 놓고 5%CO2 이하에서 37°C에서 18시간 동안 그대로 둡니다.
- 인공 세포외 기질이 코팅된 플레이트에서 분리된 부유 세포가 있는 배지를 1.5mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 1,400 x g에서 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 펠릿을 얼음 위의 인공 세포외 기질 70μl에 다시 현탁시킵니다.
- CRC 세포 생존율을 높이려면 3.5단계에서 설명한 대로 인공 세포외 기질로 코팅된 12웰 플레이트에 부착된 종양 오가노이드에 종양 세포를 포함하는 인공 세포외 기질을 오버레이합니다. 다음으로, 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 30분 동안 배양하여 인공 세포외 기질 코팅을 응고시킨 다음 5%CO2 미만에서 37°C에서 1% FCS가 있는 CRC 오가노이드 배양 배지 1mL로 배양합니다.
- 감염 후 3일 후에 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 높은 렌티바이러스 입자 역가를 사용하여 거의 100% GFP 양성을 확인했습니다(그림 2A 참조).
- CRC 오가노이드를 7-10일 동안 배양하여 세포 성장을 확장한 후 수용 마우스에 주입합니다.
6. 수혜자 마우스에서 GFP 표지 CRC 오가노이드에 의한 전이 발생
GFP 표지 CRC 오가노이드를 사용한 전이 발생을 위한 실험 절차는 그림 1C(7단계)에 요약되어 있습니다.
- GFP 표지된 CRC 오가노이드를 세포 현탁액으로 해리하려면 위에서 설명한 대로 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 기계적으로 수확하고 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다(5.1단계).
- 마이크로튜브를 1,400 x g에서 3분 동안 원심분리하고, 배양 배지를 제거한 후, 부드럽게 두드려 500μL의 PBS에서 세포 펠릿을 분해합니다.
- 마이크로튜브를 1,400 x g에서 3분 동안 원심분리하고 PBS를 제거합니다.
- 500μL의 세포 박리 용액을 튜브의 세포 펠릿에 오버레이하고 부드럽게 두드려 혼합합니다. 그런 다음, 위에서 설명한 바와 같이 부착성 CRC 오가노이드를 효소로 해리하기 위해 혼합물을 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다(5.4단계).
- 위에서 설명한 대로 1.5mL 마이크로튜브에 500μL의 1% FCS-DMEM을 추가로 500μL씩 수차례 주입하여 세포를 대략적으로 분리하여 세포 현탁액을 매우 부드럽게 피펫팅합니다(5.5단계). 가혹한 피펫팅에 의한 CRC 오가노이드에서 단일 세포를 생성하면 세포 생존율이 현저히 감소합니다. 따라서 1.5mL 마이크로튜브에서 부드럽게 피펫팅하여 세포 현탁액에서 세포 덩어리를 육안으로 검출할 수 있도록 합니다.
- 1,400 x g에서 3분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
- CRC PDX의 자연 전이 마우스 모델을 확립하려면:
- 마우스당 50% 인공 세포외 기질로 50μL의 PBS에 5 x 105개의 세포를 포함하는 세포 현탁액을 준비합니다. 사용하기 전에 얼음 위에서 서스펜션을 유지하십시오. 3.3단계에서 표시한 대로 암세포를 계수하기 위해 혈구계를 사용합니다.
- 소동물 흡입 마취 장치를 사용하여 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취하고 70% 에탄올로 피부를 소독합니다. 정상적인 호흡 속도와 깊이를 보장하고 적절한 마취를 위해 발가락 핀치 반사가 없는지 확인합니다. 수의사 연고를 눈에 바르는 것은 마취 상태에서 안구 건조증을 예방할 수 있는 옵션입니다.
- NOG 마우스를 실험실 벤치의 누운 자세로 놓습니다. 멸균 핀셋으로 직장 점막을 잡고 항문에서 부드럽게 빼냅니다. 그런 다음 즉시 6.7.1 단계에서 제조한 세포 현탁액을 주사기(바늘 크기: 22G)를 사용하여 마우스의 직장 점막하에 주입합니다. 일반적으로 그룹당 4-6마리의 마우스가 결과를 평가하는 데 사용됩니다.
