실험적 전이 마우스 모델 확립: 미세전이를 검출하기 위해 PDX 모델에 CRC 오가노이드 세포를 발현하는 GFP 이식

초록

출처: Okazawa, Y. et al. 환자 유래 결장 종양에서 배양된 GFP 렌티바이러스 형질도입 오가노이드에 의해 생성된 미세전이의 고감도 검출. J. Vis. 특급. (2018).

이 동영상은 GFP 렌티바이러스로 표지된 PDX 유래 CRC 오가노이드에 의해 면역 결핍 마우스의 비장으로 전이를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 다른 장기에 서식하는 암 미세전이는 GFP 발현을 평가하기 위해 형광 현미경을 사용하여 검출할 수 있습니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수혜자 마우스에서 GFP 표지 CRC 오가노이드에 의한 전이 발생

1. CRC PDX의 실험적 전이 모델을 확립하려면:
   1. 마우스당 50μL의 PBS에 4 x 10⁴개의 세포를 포함하는 CRC 오가노이드 세포 현탁액을 준비합니다. 사용하기 전에 얼음 위에서 서스펜션을 유지하십시오. 암세포를 계수하기 위해 혈구계를 사용하십시오. (세포 현탁액에 있는 단세포 및 다세포 클러스터를 포함하는 종양 세포의 수를 계산합니다).
   2. 소동물 흡입 마취 장치를 사용하여 이소플루란 흡입으로 마우스를 마취하고 70% 에탄올로 피부를 소독합니다. 정상적인 호흡 속도와 깊이를 보장하고 적절한 마취를 위해 발가락 핀치 반사가 없는지 확인합니다. 수의사 연고를 눈에 바르는 것은 마취 상태에서 안구 건조를 방지하기 위한 옵션입니다.
   3. 마취된 NOG 마우스를 실험실 벤치에 엎드린 자세로 놓습니다. 왼쪽 옆구리의 아래쪽을 작게 절개 한 후 복막을 절개하여 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 조심스럽게 비장을 노출시킵니다. 멸균 핀셋으로 비장에 부착된 지방 조직을 잡은 다음 세포 현탁액 50μL(위와 같이 준비, 1.1단계)를 비장에 천천히 주입합니다. 세포 현탁액이 비장에서 외부로 누출되지 않고 적절하게 주입되었는지 확인하십시오. 일반적으로 그룹당 4마리의 마우스가 결과를 평가하는 데 사용됩니다.
2. 수술 후 모든 마우스를 따뜻한 패드에 놓고 충분한 의식이 회복될 때까지 흉골 누운 자세를 유지합니다. 쥐가 완전히 회복되어 네 다리로 모두 앉을 수 있게 되면 집 우리로 되돌립니다. 포식을 방지하기 위해 같은 케이지에서 작동하지 않는 동물과 교배하는 것을 허용하지 마십시오.
3. 봉합사 누출을 확인하고 다음 날 수술 치료를 받은 그룹에서 마우스가 살아 있는지 확인합니다. 생쥐에 질병의 징후가 있는지 확인하고 일주일에 한 번 모든 생쥐에서 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정합니다.
4. 주사 후 자연 전이(최대 2.5개월 동안) 및 실험적 전이(1개월)를 감지하기 위해 마우스를 관찰합니다.
5. 표시된 날에 마취와 자궁 경부 탈구를 통해 쥐를 희생시킵니다. 원발성 종양과 간, 폐를 포함한 다양한 조직을 절개합니다. 절개된 종양과 장기를 10cm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS 5mL에 넣고 얼음에 보관합니다.
6. GFP 양성 CRC 오가노이드 세포를 검출하려면 실체 형광 현미경으로 절개된 조직을 관찰합니다. CCD 카메라로 이미지를 획득하고 표준 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 준비

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NOD/Shi-scid IL2Rγ null(NOG) 마우스	The Central Institute for Experimental Animals, 가나가와현, 일본	6주 된 수컷 마우스를 무균 및 특정 병원체가 없는 조건에서 사육
상처 클립 2×10mm	Natsume manufacturing, 일본	#C-21-S	사용 전 오토클레이브
해밀턴 주사기 바늘 크기: 22 게이지	일본 도쿄 사이언스	70% 알코올과 멸균 PBS로 소독하십시오.
50ml 원뿔형 튜브	스미토모 베이클라이트	MS-57500
마이크로튜브	에펜도르프	#0030120086	사용 전 오토클레이브
혈구계	에르마	#의 03-202-1
1% 또는 5% FCS를 함유한 CRC 오가노이드 배양 배지			1% 또는 5% FCS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 2 ng/ml hEGF 및 10 μM Y27632(ROCK 억제제)가 보충된 GlutaMAX™ 보충제(Gibco #10565018)가 포함된 DMEM/F-12. 4°C에서 보관하십시오. 1개월 이내에 사용하십시오.
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