분절 아데노-크레 감염: 유전자 조작 마우스 모델을 사용하여 고립된 대장암을 생성하는 기술

초록

출처: Betzler, A. M., et al. 산발성 대장암의 유전자 조작 마우스 모델.J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 분절 아데노-크레 감염에 의한 결장직장 마우스 모델의 생성을 설명합니다. 감염된 결장 분절은 점막의 이 분절 내에서 종양 형성을 일으켜 선종을 유발하여 궁극적으로 침습성 및 전이성 암종으로 진행됩니다. 이 모델은 암 생물학 및 전임상 치료 시험 연구를 위한 매력적인 플랫폼입니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 외과적 아데노-크레 감염을 통한 국소 종양 유도

1. 수술을 위한 동물의 준비
   메모: 사실상 모든 조건적("플록스된") 돌연변이는 여기에 기술된 방법을 통해 유도될 수 있다. Apc, Kras 또는 Tp53과 같은 대장암과 관련된 유전자의 돌연변이를 사용하는 것이 좋습니다. Cre 재조합의 효율성은 절제할 구조체의 크기에 따라 달라집니다. 큰 플록스 염기서열은 덜 효율적으로 절제됩니다. 모든 대립유전자의 재조합은 PCR에 의해 종양에서 확인되어야 합니다.
   1. 결장직장 종양의 발달을 위해 CRC(괄호 안의 MGI 데이터베이스 번호)의 기본 모델에 대해 다음 조건부 대립유전자의 십자가를 사용합니다.
      Apc^tm2Rak (MGI: 3688435)
      Kras^tm4Tyj (MGI: 2429948)
      Tp53^tm2Tyj (MGI : 3039263)
   2. 형광 리포터 대립유전자가 필요한 경우(예: 미세전이를 검출하기 위해) 다음 대립유전자를 사용합니다.
      Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze}(MGI: 3809522)
      메모: 위의 모든 균주는 NCI Mouse Repository 또는 Jackson Laboratory를 통해 구할 수 있습니다. 아데노바이러스 감염이 발생하기 전에 남아 있는 모든 배설물을 씻어낼 수 있으므로 금식이 필요하지 않습니다. 수술 전 단식은 수술 전후 사망률을 높이고, 작은 설치류에게 엄청난 스트레스를 줍니다.
   3. 전신 마취를 위해 3 - 3.5 vol%에서 sevoflurane을 사용하십시오. 발가락 핀치 반사의 상실은 충분한 마취를 나타냅니다.
   4. 첫 절개 전에 0.05mg/kg의 부프레노르핀을 피하로 주사합니다.
   5. 각막의 건조를 피하기 위해 마취된 쥐의 눈을 안과 연고로 덮습니다.
   6. 작은 테이블 위에 누운 자세로 마우스를 놓습니다. 외상이 없는 접착 테이프를 사용하여 마우스를 고정하십시오.
   7. 전기 면도기(제모 크림은 대안으로 사용할 수 있음)로 복부를 면도하고 알코올, 면봉 또는 요오드로 소독합니다. 제조업체에서 권장하는 접촉 시간을 사용하십시오.
   8. 멸균 커튼으로 수술 부위를 덮으십시오.
      메모: 수술 전후 항생제의 사용은 선택 사항이며 기관 지침에 따릅니다.
   9. 모든 수술 절차에는 멸균, 일회용 또는 멸균된 기구를 사용하십시오.
2. 정중선 개복술과 결장 노출
   1. 가위(메스를 사용할 수도 있음)를 사용하여 하복부 피부에 정중선 절개(~ 15mm)를 만듭니다.
   2. 집게로 복벽 근육 조직을 잡고 가위로 조심스럽게 절개하여 복강을 엽
   니 다.
   3. 원위 결장을 확인하고 외상성 집게로만 만지십시오. 항문에서 약 15mm 떨어진 곳에 섬세한 클램프(예: Micro Serrefine 혈관 클램프)로 결장을 고정합니다.
      메모: 항상 결장의 취약성에 특별한 주의를 기울이십시오. 천공은 필연적으로 복막염과 패혈증을 유발하며 동물의 안락사를 필요로 합니다.
3. Adeno-cre 바이러스에 의한 분절 결장 감염
   1. 유연한 테프론 튜브를 항문 방향으로 삽입하고 항문 가장자리에서 15mm 떨어진 곳에 이전에 배치된 클램프에 의해 달성된 내강 폐색에 도달할 때까지 조심스럽게 전진시킵니다. 천공이 발생할 수 있으므로 과도한 힘을 가하지 마십시오.
   2. 30G 캐뉼라로 튜브를 캐뉼러하고 표준 1mL 주사기를 연결하고 대장을 생리식염수로 세척하여 남아 있는 배설물을 배출합니다. 이를 위해서는 몇 mL의 식염수가 필요할 수 있습니다.
   3. 원위 결장이 비워지면 튜브를 제거하고 새 테프론 튜브로 교체한 다음 위에서 설명한 대로 클램프 바로 원위부에 다시 배치합니다.
   4. 근위 클램프에서 원위까지 ~ 3mm 떨어진 두 번째 클램프로 결장을 폐색하여(즉, 삽입된 튜브 위, 항문 가장자리에서 ~ 12mm) 3mm 고립된 세그먼트가 감염되도록 합니다.
      메모: 분절의 원위 폐색의 경우, Fogarty 관상동맥 클립은 고무 처리되어 클램프의 가지 사이의 내강내 튜브에도 불구하고 결장의 단단한 폐색으로 이어지기 때문에 가장 적합한 것으로 입증되었습니다.
   5. 두 번째 주사기(30G 캐뉼라가 포함된 표준 1mL)를 사용하여 0.25% 트립신-EDTA 50 - 80 μL를 고정된 결장 분절에 조심스럽게 주입하고 10분 동안 배양합니다. 액체가 역으로 누출되는 것을 방지하기 위해 캐뉼라와 주사기를 테프론 튜브에 부착된 상태로 둡니다.
      메모: 결장은 점막 장벽을 부수고 소낭선 줄기 세포에 도달하기 위해 팽창해야 하지만, 고정된 분절의 천공을 피하기 위해 너무 팽창되어서는 안 됩니다.
   6. 먼저 원위 클램프를 제거한 다음 트립신 튜브를 제거합니다.
   7. 원위 결장을 ~ 500μL의 생리식염수로 세척하여 남아 있는 트립신을 제거합니다.
   8. 새 테프론 튜브를 삽입하고 원위 클램프를 제자리에 다시 끼운 다음 결장 분절을 50 - 80 μL의 아데노바이러스 용액(인산염 완충 식염수 내^{10 11} 플라크 형성 단위(PFU)/mL)으로 팽창시키고 30분 동안 배양합니다(그림 2A).
      메모: adeno-cre와의 접촉은 조건부 돌연변이 마우스의 조직에서 종양 발생으로 이어질 수 있으므로 바이러스 용액을 흘리지 마십시오.
   9. 클램프와 튜브를 제거합니다.
4. 복부 폐쇄 및 수술 후 회복
   1. 6-0 빠르게 흡수되는 러닝 러닝 봉합사(예: 폴리디옥사논(PDS))로 복벽을 닫습니다.
   2. 수술 상처 클립으로 피부를 봉합하십시오.
   3. 마취에서 완전히 회복될 때까지 38°C로 설정된 가열 패드에 마우스를 올려 놓습니다.
   4. 수술 후 12시간 후에 0.05mg/kg 부프레노르핀 i.p.의 볼루스를 다시 투여하고, 필요한 경우 12시간마다 부프레노르핀 볼루스를 추가로 투여합니다.
   5. 적어도 하루에 한 번 쥐를 모니터링하여 종양 성장으로 인한 고통의 징후가 있는지 확인합니다.

2. 대장내시경 검사

참고: 사용된 조건부 돌연변이에 따라 아데노바이러스 감염은 2-4주 이내에 내시경으로 보이는 종양으로 이어집니다. 따라서 아데노바이러스 유도 2주 후에 첫 번째 수술 후 대장내시경 검사를 시행하고 2주마다 반복하십시오. 쥐 대장내시경 검사에는 상업적으로 이용 가능한 시스템이 권장됩니다.

1. 대장내시경을 위한 동물의 준비
   메모: 금식은 필요하지 않습니다. 나머지 대변은 일반적으로 원위 결장에서 잘 형성되어 있으며 대장내시경 검사 중에 종양 밖으로 밀려날 수 있으므로 반복적인 단식의 스트레스가 많은 과정을 불필요하게 만듭니다.
   1. 전신 마취를 위해 3 - 3.5 vol%에서 sevoflurane을 사용하십시오. 발가락 핀치 반사의 상실은 충분한 마취를 나타냅니다.
   2. 각막이 건조되지 않도록 마취된 쥐의 눈을 안과 연고로 덮습니다.
   3. 작은 테이블 위에 누운 자세로 쥐를 제지하십시오.
2. 대장내시경 검사
   1. 내시경(직경 1.9mm, 길이 10cm)을 항문을 통해 장관으로 삽입하고 시각적 통제하에 공기를 조심스럽게 흡입하여 결장을 팽창시킵니다. 검사에 필요한 것보다 더 많은 공기를 흡입하지 마십시오.
      메모: 공기 흡입을 위해 대장내시경 시스템의 김서림 방지 공기 펌프를 사용할 수 있습니다. 김서림 방지 공기 펌프를 사용할 수 없는 경우 매우 낮은 압력 설정의 다른 공기 펌프를 사용하거나 섬세한 감압 밸브가 있는 가압 공기를 사용할 수 있습니다. 이산화탄소(CO₂ )는 작은 설치류에서 산증을 쉽게 유발하므로 피해야 합니다.
   2. 원위 결장의 점막 병변이 식별될 때까지 내시경을 조심스럽게 앞으로 밉니다(그림 1A - 1D).
   3. 나중에 평가할 수 있도록 내시경 이미지를 저장합니다. 발광내 종양에 대한 내시경 채점 시스템은 이전에 설명되었습니다.
   4. 내시경을 조심스럽게 제거하고 마취에서 완전히 회복될 때까지 38°C로 설정된 가열 패드에 마우스를 올려 놓습니다.

결과

그림 1. Colonoscopic images of colorectal tumors(대장직장 종양의 대장내시경 이미지)(괄호 안에 있는 주어진 동물의 조건부 대립유전자).
A. 정상 원위 결장.B. adeno-cre 감염 후 2주 후 조기 선종. 이 마우스의 GFP 리포터 대립유전자로 인한 녹색에 주목하십시오. (Apc^tm2Rak, Kras^tm4Tyj, Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze}). C. 후기 선종(Apc^tm2Rak, Kras^tm4Tyj). D.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	생명 기술 GmbH	14190169
트립신-EDTA (0.25%, PhenolRed)	생명 기술 GmbH	25200072
생리식염수 0.9% (E154)	Serumwerk 베른부르크 AG	10013
아쿠아 광고 injectabilia	B. 브라운 멜숭겐 AG	235144
Ad5CMV-Cre(아데노바이러스, c = 2E +11 PFU/mL)	유전자 전달 벡터 코어 아이오와 대학교
15 mL, 50 mL 원심분리기 튜브	그라이너 바이오 원 GmbH	188271/227270
Eppendorf 튜브 1.5 mL/ 2 mL	사르스테트 AG & Co.	72,695,400
페트리 디쉬 PS 100/15 mm (sterile, Nuclon)	피셔 사이언티픽 GmbH	10508921/ NUNC150350
1 mL 시린지(데드 볼륨 제외) - Injekt-F SOLO	브라운/네오랩	194291661
30G 주사 바늘	벡턴 디킨슨(BECTON DICKINSON)	304000
세보플루란(Sevoflurane AbbVie)	AbbVie Germany GmbH & Co. KG
의료용 산소	에어 리퀴드 메디컬 GmbH
부프레노르핀(Temgesic)	인디비어 Eu Ltd.
Bepanthen - 안과 연고	바이엘 바이탈 GmbH	10047757
테이블 탑 연구 마취 기계 x / O2 플러시 w / Sevoflurane 기화기	파크랜드 사이언티픽	V3000PS/PK
셀룰로오스 면봉	Lohmann & Rauscher 독일	13356
인슐린 주사기 EMG 1mL(30G 캐뉼라 포함)	B. 브라운 멜숭겐 AG	9161627에스
파인 보어 튜빙 (보어 : 0.28 mm / 직경 : 0.61mm)	스미스 메디컬 독일 8	800/100/100
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