CRC 세포의 미세소관 결합 분석: 결장직장암 세포의 미세소관 결합 타우 단백질을 검사하는 방법

초록

출처: Huda, M. N., et al. 결장직장암 세포에서 타우 단백질의 국소화와 함께 인산화 및 미세소관 결합에 대한 분석. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 결장직장암 세포에서 미세소관 결합 타우 단백질을 비결합 과인산화 타우 단백질 분획에서 분리하는 데 사용되는 미세소관 결합 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 타우 단백질의 인산화 상태를 변경하여 미세소관 결합에 영향을 줄 수 있는 다양한 화학 물질의 영향을 결정하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 미세소관 결합 분석

1. 미세소관 결합 분석의 경우, 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 최소 필수 배지(MEM)가 포함된 100mm 조직 배양 접시에 ~1 x 10⁶ HCT 116 세포를 추가합니다. 배양 하루 후 세포는 60-70% 합류점에 도달합니다.
2. 20μM(40μL) 파클리탁셀과 1mM(20μL) GTP를 첨가하여 4°C에서 보관된 10X PEM 완충액에서 1X(2mL) PEM 완충액을 준비합니다. -80 °C 냉동고의 미세소관(MT) 재고와 -20 °C 냉동고의 E. coli tau 작업 재고를 예로 들어 보겠습니다.
3. 표 1에 따라 샘플을 준비합니다.
4. 37°C에서 30분간 배양, 초원심분리기, 25°C, 100,000 x g에서 60분, 초원심분리기
.
5. 결합되지 않은 타우를 포함하는 120μL의 상등액을 세척하고 라벨링된 튜브로 옮깁니다.
6. 120μL(상등액과 동일한 부피)의 5X 샘플 버퍼를 결합된 타우가 포함된 펠릿에 추가하고 완전히 혼합합니다. 용액을 라벨이 부착된 깨끗한 튜브에 옮기고 완전히 혼합합니다.
7. 상용 단백질 분석 키트를 사용하여 Bradford 분석으로 단백질 농도를 측정합니다.
   메모: 샘플을 준비하는 동안 펠릿과 상등액 샘플을 모두 준비하기 위해 용액의 부피(단계 1.6)를 사용합니다.
8. 동등한 단백질 농도의 샘플을 준비하고 DTT (400 mM)를 포함하는 새로 준비된 4x SDS 젤 로딩 버퍼를 추가합니다.
   메모: 이 단계에서 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
9. 100°C의 열 블록에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 와류를 사용하여 샘플을 혼합합니다. 실온에서 ~10-15분 동안 식힙니다.
10. SDS-PAGE의 10% 폴리아크릴아미드 겔을 실행하기 위한 전기영동 시스템을 조립합니다.
    1. 10% 폴리아크릴아미드 겔에 웰당 10μg 단백질(13μL 샘플)을 로드합니다. 분자량 사다리를 로드합니다.
    2. 샘플을 로드한 후 전기영동 시스템의 양극과 음극을 전원에 연결하여 일정한 전압을 유지합니다. 처음에는 70V에서 20분 동안 시작하여 단백질 샘플을 스태킹 겔에서 분해 겔로 이동합니다. 그런 다음 전압을 125V로 높이고 샘플과 단백질 사다리가 겔 끝에 도달할 때까지 약 70-120분 동안 겔을 실행합니다.
    3. 전기영동이 완료된 후 습식 전기블로팅 시스템을 사용하여 겔을 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다. 100V에서 ~100분 동안 전송합니다.
    4. 분자량 사다리의 측면에 작은 상처를 만들어 얼룩을 표시합니다. 투명 플라스틱 시트와 날카로운 커터를 사용하여 얼룩을 절단하십시오.
11. 실온에서 90분 동안 4% BSA 차단 버퍼로 멤브레인을 차단합니다.
12. 1차 항체 용액(anti-tau at 1:5,000)에서 4°C에서 블롯을 하룻밤 동안 배양합니다. PBST에서 각각 7분 동안 얼룩을 네 번 씻습니다.
13. 관련 2차 항체 용액(염소 항-마우스 IgG 1:5,000)을 준비하고 실온에서 90분 동안 블롯을 배양합니다. PBST로 각각 7분씩 4번 씻습니다.
14. 제조업체의 권장 사항에 따라 화학발광 키트를 사용하여 블롯을 개발합니다. 투명 플라스틱 랩으로 얼룩을 덮으십시오. 관련 소프트웨어를 사용하여 화학발광을 위한 화학발광 이미징 시스템으로 이미지를 획득합니다.

표 1: 미세소관 결합 분석을 위한 시료 준비.

개 개 개 개

견본	이름	미세소관 필요	필요한 주요 단백질	PEM-GTP-PTX
1	HCT 116-대조군 (6.21 μg/μl)	2 μl	9.66 μl (60 μg)	108.34 μl의
2	HCT 116-커큐민 10μM(4.81μg/μl)	2 μl	16.63 μL (80 μg)	101.37 μl의
3	HCT 116-커큐민 20μM(3.28μg/μl)	2 μl	30.49 μl (100 μg)	87.51 μl
4	HCT 116-LiCl 25mM(5.43μg/μl)	2 μl	18.42 μl (100 μg)	99.58 μl
5	대장균 타우	2 μl	1μl 타우-352	117 μL
6	MT 전용	2 μl	엑스	118 μl
				각 120 μl

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HCT 116 셀	증권 시세	CCL-247
MEM (EBSS)	하이클론	SH30024.01
100mm 접시	코 닝	430161
Anti-Tau 13 항체	아브캠	AB19030
디티오트레이톨(DTT)	로슈	전화: 10 708 984 001	보관 온도 2–8 °C
마이크로리터 원심분리기	헤티히 젠트리푸겐	마이크로 200 R
파클리탁셀	시그마-알드리치	T1912	보관 온도 2–8 °C
커큐민	시그마-알드리치(Fluka)	78246	보관 온도 2–8 °C
미세소관(MT)	세포골격	MT001	4 °C에서 보관하십시오 (건조시).
수산화나트륨	시그마	72068
염화마그네슘	시그마-알드리치	M2670
지티피(GTP)	시그마-알드리치	G8877	-20 °C에서 보관하십시오
디피에스	웰진	LB 001-02
음파 디스멤브레이터	피셔 사이언티픽	모델 500
초원심분리기	벡크만 쿨터	옵티마 L-100 XP
소 혈청 알부민(BSA)	시그마	A7906
분자 이미저	바이오 라드	케미독 XRS+	4 °C에서 보관하십시오
단백질 분석 염료 시약	바이오 라드	전화: 500-0006
α-튜불린(11H10) 토끼 mAb	세포 신호 전달	2125
GAPDH (14C10) 토끼 mAb	세포 신호 전달	2118
Anti-Tau (phospho S396) 항체	아브캠	AB109390
타우-352 인간	시그마	전화 9950	-20 °C에서 보관하십시오
PVDF 멤브레인	바이오 라드	Tel.: 162-0177
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	어피메트릭스	75819
단백질 분석	바이오 라드	전화: 500-0006	4 °C에서 보관하십시오
Goat anti-mouse IgG 2차 항체	써모피셔	A-11005	4 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.

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