전혈 샘플에서 CTC 분리: 쥐 대장암 모델에서 CTC를 얻는 방법

초록

출처: Kochall, S., et al. 대장암의 정형토픽 마우스 모델에서 순환 종양 세포의 격리. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 안락사된 결장직장 종양 마우스 모델의 전혈 샘플에서 순환 종양 세포를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 분리된 CTC는 배양하여 의도한 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 전혈 샘플에서 순환 종양 세포 분리

참고: 마취된 쥐에게 경피적 심장 천자로 혈액을 채취한 후 안락사를 합니다. 이상적으로는 1,000μL의 혈액을 100μL의 항응고제(에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 헤파린)으로 미리 채워진 주사기로 주입합니다. 항-인간 EpCAM(상피 세포 접착 분자) 항체를 사용하여 CTC를 식별합니다. 이는 인간 상피 세포주가 마우스 모델에 사용되는 경우 매우 잘 작동합니다. 다른 응용 분야의 경우 다른 항체가 필요할 수 있습니다.

1. CTC 농축:
   1. 15mL 튜브를 5mL 밀도 구배 배지로 미리 채우고 혈액을 15mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
   2. 원심분리기(브레이크 없이 300 x g에서 30분)를 하고 상부 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
   3. 나머지를 새 15mL 튜브와 원심분리기에 붓습니다(15분, 300 x g, 브레이크 포함).
   4. 단핵 세포를 포함하는 계면을 복구하고(나머지는 폐기) PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
   5. 펠릿을 200μL PBS/1% EDTA에 재현탁하고 4μL의 EpCAM 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
2. 스크리닝 및 피킹
   1. PBS + 10% 태아 송아지 혈청(FCS) + 1% 페니실린/스트렙토마이신(1%) + 0.8% EDTA를 준비합니다.
   2. PAP 펜을 사용하여 6cm 멸균 페트리 접시에 ~1cm 원을 그리고(액체가 접시에 분산되는 것을 방지) 이 원에 700μL의 피펫 완충액
   을 넣습니다.
   3. 원 내의 700μL 피킹 버퍼에 50μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 현미경으로 세포의 밀도를 확인합니다. 샘플이 너무 조밀하면 다른 접시로 나눕니다.
   4. 세포가 안정될 때까지 기다립니다(~5분).
   5. 염색된(= EpCAM 양성) 세포에 대한 세포 현탁액의 드롭을 스크리닝합니다.
   6. 세포가 발견되면 micromanipulator로 세포를 선택하고 의도한 다운스트림 분석(예: RNA 추출 완충액 또는 배양 배지)에 따라 50μL 완충액에 넣습니다.
   7. 의도한 다운스트림 분석에 따라 EpCAM 음성 세포 및/또는 배지를 음성 대조군으로 분리합니다.
   8. 다운스트림 분석(예: 세포 배양, PCR)을 진행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
밀도 구배 매체 – Ficoll	스템셀 - 림포렙	7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) 항체 클론 9C4	바이오레전드	324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) 항체 클론 G8.8	바이오레전드	118210
페트리 접시, ø 60 x 15 mm, 21 cm², 통풍	그라이너 바이오 원	628102
형광 세포 배양 현미경	라이카
Transferman 4r 마이크로 매니퓰레이터	에펜도르프
셀트램 에어	에펜도르프		micromanipulator에 연결된 흡인 펌프
DMZ 범용 미세 전극 풀러	다간 코퍼레이션		single cell aspiration을 위한 micro capillary의 제조에 필요
프리즘 유리 모세 혈관	다간 코퍼레이션
PAP 펜	아브캠
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	생명 기술 GmbH	14190169	버퍼 선택
송아지 태아 혈청(FCS)	바이오크롬 AG	에스 0115	버퍼 선택
페니실린/스트렙토마이신(PenStrep)	생명 기술 GmbH	15140122	버퍼 선택
에디타	로스	8040.1	버퍼 선택
면역조직화학(Immunohistochemistry
정제된 항인간 CD326(EpCAM) 항체 클론 9C4	바이오레전드	324201	EpCAM 면역조직화학
HRP 토끼 안티 마우스 IgG	아브캠	AB97046	EpCAM 면역조직화학

년 구 )