레이저 미세해부: 3D 유기형 배양 모델에서 침입하는 대장암 세포를 분리하는 기술

초록

출처: Bullock M. et al., Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts. J. Vis. 특급. (2014).

이 비디오는 미크론 수준의 정밀도로 3D 유기형 공동 배양 모델의 레이저 해부를 설명합니다. 3D 유기형 모델에서는 섬유아세포와 같은 기질 성분이 암 상피 세포와 3차원으로 공동 배양됩니다. 3D 모델은 생리학적 조건에 가까운 조건에서 침입 및 암-기질 상호 작용을 연구할 수 있는 실험 도구 역할을 합니다.

프로토콜

1. 유기형 준비:

섬유아세포 함침 유기형 겔의 준비:

1. 10% FCS 및 292μg/ml L-글루타민이 보충된 DMEM에서 유기형당 5 x 10⁵개의 세포를 포함하는 섬유아세포 현탁액을 준비합니다.
2. 얼음 위에서 유기형 젤을 다음 비율로 구성합니다.
   • • 랫테일 콜라겐 7종: 마트리겔 믹스 (1:1)
   • • 여과된 10x DMEM 1개 부피
   • • FCS 1권
   • • 5 x 10⁵ 섬유아세포를 함유하는 섬유아세포 현탁액 1부피
     9 젤 (젤 당 1ml)의 경우 10ml를 준비하고 거품이 생기지 않도록 부드럽게 섞습니다.
3. 24웰 플레이트의 각 웰에 1ml를 넣고 가습된 분위기에서 37°C에서 1시간 동안 배양하여 젤이 굳을 수 있도록 합니다. 1시간 후, 겔 위에 1ml DMEM(10% FCS)/글럿을 넣고 밤새 인큐베이터에 다시 넣습니다.
4. 다음 날, 겔 상단에서 배지를 흡인하고 5 x 10⁵ CRC 상피 세포가 포함된 배지 1ml를 플레이트에 넣습니다.

젤 코팅 된 나일론 시트의 준비 :

5. 1.5cm x 1.5cm 크기의 멸균 오토클레이브 나일론 시트를 미리 준비합니다.
6. 멸균 집게를 사용하여 10cm 배양 접시에 필요한 수의 나일론 시트를 놓습니다(일반적으로 접시당 4개의 나일론 시트를 수용할 수 있음).
7. 다음 순서로 얼음에 젤을 구성하십시오 (나일론 시트 당 250 μl의 총 부피가 필요함).
   • • 랫테일 콜라겐 7 볼륨
   • • 여과된 10x DMEM 1개 부피
   • • FCS 1권
   • • DMEM 10% FCS/glut 1
   부피
8. 용액이 노란색인 경우 용액이 분홍색으로 변할 때까지 50μl 분취량에 0.1M NaOH를 첨가하여 중화합니다.
9. 이 용액 250 μl를 각 나일론 시트에 첨가하고 겔이 굳을 수 있도록 30 분 동안 5 % CO₂의 가습 분위기에서 37 ° C에서 배양합니다.
10. PBS에 있는 메이크업 1% 글루타르알데히드 해결책. 젤이 굳으면 각 10cm 배양 접시에 10ml를 넣고 4 ° C에서 1 시간 동안 배양합니다.
11. 나일론 시트를 PBS에서 3배, DMEM(10% FCS)/Glu에서 1배로 세척하고 4°C에서 DMEM/Glu로 밤새 배양합니다.

침입을 위해 강철 그리드에 유기형 젤을 올리는 것:

12. 스테인리스 강판을 삼각대 형태로 접어 비계 그리드를 미리 준비합니다. 사용하기 전에 오토클레이브.
13. 에탄올로 멸균된 집게를 사용하여 6웰 플레이트의 각 웰에 강철 그리드를 배치합니다.
14. 콜라겐 쪽이 가장 위에 오도록 젤 코팅된 나일론 시트를 각 그리드에 놓습니다.
15. 에탄올로 멸균된 주걱을 사용하여 24웰 플레이트의 유기형 겔을 융기된 나일론 시트로 조심스럽게 옮깁니다.
16. 나일론 시트가 매체와 접촉하지만 물에 잠기지 않을 때까지 10% FCS가 보충된 DMEM 10% FCS/Glut로 웰을 채웁니다. 매체가 유기형 젤에 닿지 않는지 확인하십시오.
17. 37 ° C에서 14 % CO₂의 가습 분위기에서 2 일 동안 배양하고 2 일마다 배지를 교체합니다.

2. 유기형 고정

1. 우물에서 나일론 시트를 포함한 전체 유기형을 제거하고 접착 필름에 놓습니다.
2. 깨끗한 일회용 메스를 사용하여 유기형과 나일론 시트를 이등분하고 실온에서 24시간 동안 포름알데히드로 양쪽 반쪽을 고정합니다.
3. 24시간 후에 포름알데히드를 70% 에탄올로 대체하고 파라핀에 삽입, 절편 및 염색하기 전에 밤새 그대로 두십시오.

3. 침습적 가장자리의 레이저 미미해부

1. 멤브레인 장착 슬라이드에 10μm 두께로 절단합니다.
2. 1분 동안 자일렌을 도포하여 절편을 분리한 다음 자일렌을 제거하고 75% 에탄올을 1분 더 고정합니다.
3. 에탄올을 제거하고 0.125% 크레실 바이올렛 용액으로 1분 동안 염색합니다. 크레실 바이올렛은 상피 세포를 강조하고 기질을 쉽게 구별할 수 있습니다.
4. Cresyl Violet을 제거하고 100% 에탄올로 헹구기 전에 100% 에탄올을 1분 더 바르십시오. 슬라이드를 30분 동안 자연 건조시킵니다.
5. 선택한 플랫폼(예: Leica AS 시스템)을 사용하여 레이저 현미해부를 수행합니다.
6. 미세 해부할 염색 부분이 있는 유리 슬라이드를 현미경 스테이지에 앞면이 아래로 향
하게 놓습니다.
7. 0.5ml 미세 원심분리 튜브를 수집 카세트에 장착하고 미세 해부된 조직이 수집될 캡에 50μl의 세포 용해 완충액(예: DNA, RNA 또는 단백질 용해 완충액)을 추가합니다.
8. 직접 시야 아래에서 조이스틱을 사용하여 관심 조직을 식별합니다. 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 염색된 유기 단면에 주석을 달아 종양 침입 전선에서 미세 해부할 세포를 강조 표시합니다.
9. 레이저가 발사되도록 지시하면 강조 표시된 부분을 잘라내고 미세 해부된 조직을 미세 원심분리기 튜브의 캡으로 밀어 넣어야 합니다.
10. 충분한 물질이 수집되면 수집 카세트를 꺼내고 마이크로 원심분리기 튜브를 닫은 다음 부드럽게 회전하여 용해 버퍼를 튜브 바닥으로 끌어당깁니다.
11. 현저해부가 완료될 때까지 얼음 위에 샘플을 놓습니다. 적절한 방법으로 샘플을 처리하여 관심 분석물을 추출합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
대장암 세포주 - 예시: SW480	증권 시세	ATCC CCL-228
콜라겐	BD 바이오사이언스	354265
마트리겔	BD 바이오사이언스	354234
나일론 멤브레인	머크 밀리포어	VVLP01300
금속 격자	메쉬 컴퍼니	WSS20-A4	themeshcompany.com
레이저 현미해부 플랫폼	라이카 마이크로시스템즈	라이카 AS LMD
멤브레인 장착 슬라이드	분자 장치
크레실 바이올렛	머크 밀리포어	1052350025