견인 세포 분석 분석: ECM에서 암세포가 가하는 견인력을 정량화하는 방법

Abstract

출처: Ali, M. Y., et al. 수술 조직에서 일차 인간 결장 종양 세포를 분리하고 견인 세포 분석을 위한 부드러운 탄성 기질에 직접 배양. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 견인력 현미경 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광 비드가 내장된 연질 탄성 하이드로겔에 존재하는 세포외 기질에서 인간 대장암 세포의 세포 견인을 측정합니다. 형광 비드의 결과 변위는 적절한 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다.

Protocol

1. 견인력 현미경 분석

1. 견인 실험을 시작하기 전에 0.25% 트립신-EDTA/10% SDS 용액을 37°C의 수조에서 10분 동안 데웁니다.
2. 세포 배양 인큐베이터에서 한 번에 하나의 겔(ECM 분자, 50μg/ml 농도의 인간 피브로넥틴이 포함된 PA 젤 및 유리를 기능화)을 제거하고 형광 도립 현미경 스테이지(32X 배율)에 놓습니다.
3. 시야에서 단일 셀을 찾습니다. 페트리 접시 뚜껑을 제거합니다.
4. 세포의 위상차 이미지를 촬영합니다(예: 그림 1).
5. 이미징 모드를 형광으로 전환하고 적절한 필터를 선택합니다. 현미경을 이동하지 마십시오.tage 또는 samp이 시간 동안.
6. 세포 견인에 의해 변위된 형광 구슬의 이미지를 촬영합니다(그림 2C).
7. 페트리 접시에 1ml의 트립신/SDS 용액을 첨가하여 젤에서 세포를 분리합니다. 현미경을 이동하지 마십시오.tage 또는 samp이 시간 동안. 또한 겔에서 완전히 제거되도록 세포의 대조 이미지를 촬영합니다.
8. 세포가 제거된 후 비드의 참조(null force) 이미지를 촬영합니다.
9. 다른 모든 젤에 대해 1.2-1.8단계를 반복합니다.
10. 각 사례에 대해 1.6 및 1.8 단계에서 얻은 두 이미지에서 ImageJ를 사용하여 이미지 스택을 만듭니다. 이미지 스택을 생성하려면 이미지를 연 후 ImageJ에서 이미지 → 스택 → 스택할 이미지 명령을 사용합니다.
11. 변위 필드와 견인력을 얻으려면 게시된 방법에 따라 ImageJ 플러그인을 사용하십시오. 다음 링크를 사용하여 이러한 플러그인에 대한 코드 및 자세한 자습서를 얻으십시오: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. 'Template Matching' 플러그인을 사용하여 스택의 이미지를 정렬합니다. 1.10단계에서 생성된 이미지 스택을 연 후 ImageJ에서 Plugins → Template Matching → Align Slices in Stack → OK 명령 시퀀스를 사용합니다. 결과적으로 이미지 스택을 저장합니다. 다음 단계에서 이 새 이미지 스택을 사용합니다.
    2. PIV(particle image velocimetry) 플러그인을 사용하여 변위 필드를 얻습니다(그림 2D). 1.11.1단계에서 저장한 이미지 스택을 연 후 다음 명령 시퀀스를 사용합니다. 플러그인 → PIV → 반복 PIV(기본) → 확인 → 이 PIV를 수락하고 확인을 → 출력합니다. PIV 출력을 원본 이미지 스택과 동일한 디렉터리에 저장합니다. 다음 단계에서 이를 입력으로 사용합니다.
    3. 마지막으로 FTTC(Fourier transform traction cytometry) 플러그인을 사용하여 견인 맵을 얻습니다(그림 2E). 다음 명령 순서를 사용합니다. FTTC → 플러그인 → 재료 속성, 즉 PA 겔 →의 영률 및 푸아송 비율 삽입 확인 → 1.11.2 단계에서 저장한 PIV 출력 파일을 선택합니다 → 확인. FTTC 결과를 이미지 스택 및 PIV 출력과 동일한 디렉토리에 저장합니다.

Results

그림 1. 다양한 강성 젤과 폴리스티렌 접시에서 성공적인 1차 인간 결장 세포 배양(암 및 정상 모두). 위상차 이미지는 서로 다른 강성 기질에 있는 (A) 종양 세포와 (B) 정상 세포의 전형적인 형태를 보여줍니다.

그림 2. (A) 침습성 선암을 확인하는 H & E 염색. (B) 피브로넥틴 염색은 겔이 ECM 분자로 균일하게 코팅되어 있음을 나타냅니다. (C) 신탁 마커로 겔 내...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (PBS)	론자	17-516층
트립신	워 딩 턴	LS003736
아크릴아마이드	시그마-알드리치	A4058
N-메틸렌비스아크릴아미드(비스)	시그마-알드리치	M1533
인간 피브로넥틴	BD 생명과학	354008
0.1 μm 형광 비드	생명 기술	F8801
0.25% 트립신-EDTA	생명 기술	제25200-056
12mm2 유리 커버 슬립	코 닝	2865-12