Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: 기질의 세포 접착 및 확산을 연구하기 위한 면역형광 기반 방법

초록

출처: Ali, M. Y et al., 수술 조직에서 일차 인간 결장 종양 세포를 분리하고 견인 세포 분석을 위한 부드러운 탄성 기질에 직접 배양. J. Vis. 특급 (2015)

이 동영상은 기질 강성에 따른 변형을 이해하기 위해 원발성 인간 대장암 세포의 세포골격 및 국소 접착을 연구하는 기술을 설명합니다. 연질 및 경질 기질에서 암세포를 배양하면 암 예후를 위한 다양한 다운스트림 생물물리학적 측정이 가능합니다.

프로토콜

1. 면역형광 현미경 검사 분석

1. 면역 염색할 세포가 있는 기질을 층류 후드로 취하고 배양 배지를 제거합니다.
2. PBS로 기질을 헹구고 RT에서 20분 동안 PBS에 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다.
3. PBS로 기판을 세 번 세척합니다(매번 5분). 따라서 500μl 신호 인핸서로 기질을 30분 동안 배양하고 PBS로 헹굽니다.
4. PBS에서 1:250 희석으로 단클론 항 빈쿨린 항체가 있는 세포를 RT에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 기판을 3회(매번 5분) 세척합니다.
5. 2차 항체 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG를 30분 동안 RTS에서 PBS에서 1:200으로 희석하여 샘플을 배양합니다. PBS로 기질을 3회(매번 5분) 세척합니다.
6. F-actin 구조를 시각화하기 위해 RTITC phalloidin conjugate로 세포를 50μg/ml의 농도로 RT에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 기판을 3회(매번 5분) 세척합니다.
7. 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다(그림 1A-1D).

결과

그림 1. 소프트 젤 및 경질 폴리스티렌 기질에 F-actin 및 vinculin의 면역 형광 염색.부드러운 2kPa 겔의 덜 퍼진 (A1) 종양 세포 또는 (A2) 정상 세포에는 액틴 섬유가 존재하지 않았습니다. 그러나 반점 빈큘린을 함유한 국소 접착은 연질 젤(B1-B2)에 존재합니다. 반대로, 일차 세포는 경질 폴리스티렌 기질에서 잘 퍼진 형태, 잘 정의된 액틴 응력 섬유(C1-C2) 및 개별 길쭉한 초점 접착(D1-D2)을 보여줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
PBS (PBS)	론자	17-516층
파라포름알데히드	전자 현미경 과학	RT15710
신호 인핸서	생명 기술	I36933
단클론 anti vinculin 항체	시그마-알드리치	V9131
Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG	생명 기술	A11001
TRITC phalloidin 접합체	시그마-알드리치	P1951
자료
12mm2 유리 커버 슬립	코 닝	2865-12

시리즈 (영문) 년