냉동 피부 조직 블록 준비: 쥐 등쪽 피부의 피부 흑색종 샘플을 보존하기 위한 프로토콜

초록

출처: Moon, H., et al. 돌연변이 멜라닌 세포 줄기 세포에서 쥐 흑색종 시작의 공간 및 시간 제어. J. Vis. 특급 (2019년)

이 동영상은 흑색종이 함유된 쥐의 등쪽 피부를 분리한 후 동결 피부 조직 블록을 준비하기 위한 크라이오 임베딩에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 극저온 내장 조직 블록은 흑색종 진행을 연구하기 위해 절편화하고 현미경으로 검사할 수 있습니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 조직 처리

1. 피부 격리
   1. 시작하기 전에 다음을 얻으십시오: 부검 도구, 여과지 및 종이 타월.
   2. 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시키고 진행하기 전에 사망을 확인합니다.
   3. 이발기를 사용하여 등 피부 부위의 털을 면도합니다. 보푸라기가 없는 티슈로 해당 부위를 가볍게 솔질하여 해당 부위를 청소합니다.
   4. 꼬리 아랫부분 바로 위에 날카로운 가위로 작게 절개합니다.
   5. 절개 부위에 크고 뭉툭한 가위를 삽입하고 피하 결합 조직을 분리합니다.
   6. 조직 가장자리를 따라 날카로운 가위로 잘라 관심 있는 피부 부위를 조심스럽게 분리하십시오.
   7. 깨끗한 종이 타월에 피부 조직을 놓고 둔한 집게를 사용하여 피부가 수건에 밀착되어 팽팽하게 당겨지도록 합니다. 이 단계는 조직을 추가로 지지하여 모양을 유지하면서 조작하고 처리할 수 있도록 하는 역할을 합니다.
      메모: 집게가 조직에 손상을 일으켜 조직학적으로 볼 수 있는 손상을 일으킬 수 있으므로 피부 조직의 바깥쪽 영역만 취급하도록 주의하십시오.
2. 조직 고정
   1. 여과지를 반으로 접고 적절하게 라벨을 붙입니다. 주름 바로 옆에 접힌 종이에 종이 타월 뒷면과 함께 피부를 놓고 샘플이 매끄럽고 접히거나 구겨지지 않았는지 확인합니다. 열린 면을 스테이플링하여 여과지를 밀봉한 다음 남은 용지를 향후 샘플에 사용할 수 있도록 다듬습니다.
      메모: 이 단계는 고정하는 동안 피부가 모양을 유지하도록 수행됩니다.
   2. 조직 샘플을 10% 중성 완충 포르말린에 실온에서 3-5시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 완전히 담그십시오.
   3. 고정 후 포르말린에서 샘플을 제거하고 탈이온수(각 2x 5분)로 세척한 다음 조직 블록을 만듭니다. 피부 조직에서 잔여 물질(즉, 잔여 종이)을 조심스럽게 제거합니다.
3. 냉동 조직 블록 만들기(그림 1)
   1. 피부 샘플의 가장자리를 잘라 들쭉날쭉하지 않게 한 다음 시상면을 3번 자릅니다. 이 스트립의 너비는 cryomold의 높이(5mm)보다 크지 않아야 합니다. 다음으로, cryomold의 너비(20mm)보다 길지 않고 내장할 수 있는 피부 조각을 갖도록 가로 절단을 합니다. 등 피부의 나머지 절반에 대해 반복하거나 다른 용도로 조직을 저장하십시오 (또는 고정하기 전에 절반을 저장).
      메모: 피부 조각을 올바른 방향으로 유지하는 것이 중요합니다.
   2. 크라이오몰드(25 x 20 x 5 mm³)를 세로 방향으로 향하게 하고 OCT 위에 4-5개의 피부 조각을 놓습니다. 모든 조각이 제자리에 고정되면 2쌍의 미세한 집게를 사용하여 피부의 긴 가장자리를 크라이오몰드 바닥으로 가져옵니다. 이제 피부가 금형 바닥에 수직으로 OCT에서 서있어야 합니다. 이 단계에서 OCT 내에 공기 주머니가 형성되는 것을 최소화하도록 주의하십시오(그림 1).
   3. 두 번째 립에 OCT를 채우고 드라이 아이스의 평평한 표면에 놓습니다. 집게를 사용하여 블록이 얼기 시작할 때 전송 중에 이동했을 수 있는 피부 조각을 조정합니다. 바닥층이 응고되면 조직 조작이 불가능합니다.
   4. 분석을 위해 8-10μm 슬라이드를 자릅니다.
4. 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 조직 블록 만들기
   1. 라벨이 붙은 카세트에 고정된 피부 2개를 넣고 에탄올 농도를 높여 탈수합니다(75% 에탄올은 30분 동안, 85%는 30분, 90%는 30분, 95%는 30분, 100%는 2x 30분, 자일렌 또는 크실렌 대체물은 2x 30분). 58-60°C에서 파라핀으로 배양하되, 처음에는 30분 동안, 그 다음에는 하룻밤 동안 배양합니다.
   2. 액체 파라핀이 있는 24 x 24mm² 스테인리스 스틸 조직 몰드에 조직을 삽입하고 -5°C에서 응고시킵니다. 조직 방향은 여러 모낭에 걸친 세로 단면을 시각화할 수 있도록 동결 조직 블록의 방향과 유사해야 합니다(그림 1).
   3. 파라핀이 응고되면 금형을 제거하고 분석을 위해 5-10μm 섹션으로 자릅니다.

결과

그림 1: 피부 조직 분리 및 크라이오 임베딩(cryo-embedding). 안락사 후 마우스의 관심 등 피부 부위를 면도하고 OCT가 함유된 cryomold에 피부를 삽입합니다. 마우스의 점선은 중간선을 나타냅니다. 일반적으로 3개 또는 4개의 피부 조각은 정중선을 따라 3-4개의 선분으로 분리할 수 있습니다. 그러한 조각 중 하나는 직사각형 1/2/3/4로 표시됩니다. 이러한 스킨 조각은 그림과 같이 OCT에 삽입되어야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
애완 동물 헤어 트리머	왈	제09990-502
제모 크림	나이르	해당 없음	대부분의 약국에서 구입할 수 있습니다
면봉	다양한
자외선 전구	증권 시세	Tel.95-0042-08	모델 XX-15M 미드레인지 UV 램프
200 프루프 에탄올	다양한		순수 에탄올
히스토플라스트 PE	피셔 사이언티픽	22900700	파라핀 펠릿
중성 완충 포르말린, 10%	시그마	HT501128-4L
O.C.T. 컴파운드	열	23730571
조직 카세트	사쿠라	89199-430	FFPE 가공용
크라이오몰드	사쿠라	4557	25 x 20 밀리미터
FFPE 금형	라이카	3803082	24mm x 24mm
이소플루란	다양한		수의학 등급
마취 흡입 시스템	다양한		수의학 등급
파인 가위	증권 시세	14085-09	스트레이트, 샤프/샤프
파인 가위	증권 시세	14558-09	스트레이트, 샤프/샤프
집게	증권 시세	11252-00	뒤몽 #5
집게	증권 시세	11018-12	마이크로 Adson
티르-크리어; LSL-브래프V600E; 포인트 f/f	잭슨 연구소	13590
LSL-td토마토	잭슨 연구소	7914	AI14

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