환자 유래 이종이식 모델링: 흑색종 마우스 모델을 생성하는 기술

초록

출처: Min Xiao et al. 흑색종 환자 유래 이종 이식 모델. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 인간 유래 흑색종 세포를 면역이 저하된 마우스의 옆구리에 피하로 이식합니다. PDX 모델을 사용하면 생체 내 조건에서 관찰된 종양 이질성과 흑색종 공격성을 더 잘 요약할 수 있는 흑색종 세포의 전임상 조사를 수행할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 이식을 위한 종양 조직 처리

1. 외과적 절제 또는 외과적 생검 조직 처리
   1. 조직을 멸균된 페트리 접시에 옮기고 종양 조직을 주변의 정상 조직과 최대한 분리합니다.
   2. 남아 있는 종양에서 괴사 조직(일반적으로 종양 내 중앙에 위치한 창백한 조직으로 식별됨)을 가능한 한 많이 제거합니다.
   3. 메스를 사용하여 초기 종양 덩어리를 외과용 마우스 이식을 위해 거의 동일한 조각(~3mm x 3mm)으로 세분화합니다(그림 1).
   4. 선택적으로, 충분한 종양 조직을 사용할 수 있는 경우 다운스트림 분석(RNA 염기서열분석[RNASeq], 전체 엑솜 염기서열분석[WES] 등)을 위해 조직을 스냅-동결합니다.
   5. 두 개의 메스 날이 있는 십자 블레이드 기술을 사용하여 종양 조직을 다져 종양 슬러리를 만듭니다. 종양 덩어리를 가능한 한 곱게 다져 슬러리를 형성하면 이제 외과용 마우스 이식 준비가 되었습니다.
   6. 또는 종양 조직이 너무 단단하여 기계적 해리가 불가능한 경우 분해 해리 절차를 사용하여 젤 같은 슬러리와 이식 및/또는 주입을 위한 단일 세포 현탁액을 형성합니다.
      1. 종양 덩어리를 가능한 한 곱게 다져 슬러리를 형성합니다.
      2. 슬러리를 차가운 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)^-/-(Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 제외)과 함께 50mL 튜브에 넣고 4°C에서 4분 동안 220 x g에서 펠릿을 원심분리합니다.
      3. 종양 조직 1g당 10mL의 예열된 신선한 소화 매체(200 U/mL 콜라겐분해효소 IV + 5mM CaCl₂ + HBSS^의 50 U/mL DNase)에 슬러리를 재현탁합니다.
      4. 튜브를 37°C 수조에 20분 동안 넣고 일회용 피펫으로 5분마다 세게 섞습니다.
      5. 최대 50mL의 ^HBSS로 세척합니다. 그런 다음 220 x g에서 4°C에서 4분 동안 원심분리합니다.
      6. 종양 조직 1g당 예열된 TEG 5mL(0.025% 트립신 + 40μg/mL 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산[EGTA] + 10μg/mL 폴리비닐 알코올[PVA])을 넣고 부드럽게 재현탁/흔든 후 튜브를 섞지 않고 37°C에서 2분 동안 놓습니다.
      7. 최소 1개의 동일한 부피의 저온 염색 매체(1% 소 혈청 알부민[BSA] + 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산[HEPES] + L15 배지의 1x 페니실린-스트렙토마이신)을 추가하여 트립신을 퀀징하고 4°C에서 4분 동안 220 x g에서 원심분리
      를 합니다.
      8. 종양 조직 1g당 10mL의 염색 배지에 샘플을 재현탁하고 40μm 세포 여과기를 통해 여과하여 마우스 주입을 위한 단일 세포 현탁액을 얻습니다(그림 1).
      9. 세포 여과기 위에 남아 있는 슬러리는 외과용 마우스 이식을 위해 수집할 수도 있습니다.
2. 마우스의 종양 이식 및 주입
   1. 외과적 절제 또는 외과적 생검 조직의 이식
      메모: 모든 수술 기구는 고압멸균 또는 사전 멸균된 일회용 기구를 사용하여 멸균 상태인지 확인합니다.
      1. NSG 6-8주 수컷 또는 암컷 마우스의 등 아래쪽 털을 면도하여 털이 없는 약 1.5cm x 3cm 영역을 남깁니다. 이소플루란을 사용하여 생쥐를 마취하고 반응성 테스트로 발을 부드럽게 쥐어 확인합니다. 건조함을 방지하기 위해 수의사의 연고를 눈에 바르십시오.
      2. 마취 기계의 코 원뿔에있는 열 패드에 개별 마우스를 놓고 클로르헥시딘으로 면도 한 부위를 문지릅니다. 그런 다음 70% 에탄올을 적셔 증발시킵니다.
      3. 덩어리를 준비하거나 페트리 접시에 담긴 종양 슬러리를 외과적 이식을 위해 개별 마운드로 나눕니다(즉, 3마리의 마우스에 이식할 경우 3개의 동일한 마운드로
      ).
      4. 메스 날을 사용하여 마우스 뒤쪽 중앙을 약 5mm 길이로 절개하고 집게 한 쌍을 잡고 작업자의 반대쪽 절개 부위 쪽의 피부를 들어 올립니다.
      5. 다른 손에 가위를 들고 작은 가위 절단으로 근막을 부드럽게 잘라 근육층에서 피부를 분리하여 종양 조직을위한 "주머니"를 만듭니다.
      6. 메스 날로 종양 덩어리 하나 또는 종양 슬러리 조직 덩어리 하나를 집어 들고 생성된 주머니에 조직을 부드럽게 넣습니다.
      7. 100μL의 인공 세포외 기질(artificial extracellular matrix)을 주머니의 종양 조직 둔덕에 투여합니다.
      8. 두 쌍의 집게를 사용하여 양쪽 끝의 절개 부위를 당겨 상처 가장자리가 서로 밀착되도록 하고 하나 또는 두 개의 상처 클립을 적용하여 상처를 봉합합니다.
      9. 수술 후 진통제로 1-5mg/kg meloxicam을 마우스에 피하주사합니다.
      10. 콧방울에서 마우스를 꺼내 원래 케이지에 다시 넣고, 깨어나는 동안 마우스를 관찰합니다. 완전히 회복될 때까지 케이지로 돌아가지 마십시오.
      11. 약 7일 후에 상처 클립을 제거합니다. 7일 후에도 치유가 완료되지 않으면 상처 클립을 하루나 이틀 더 그대로 두십시오.
          메모: 외과적 절제 또는 외과적 생검 조직 처리로 인한 단세포 현탁액을 사용하는 경우 마우스 주입을 위해 인공 세포외 기질(1:1 비율)과 혼합됩니다.
   2. FNA 또는 코어 생검 조직 주입
      1. NSG 마우스를 강철 그리드 랙에 놓고 마우스의 꼬리를 단단히 잡고 마우스를 부드럽게 뒤로 당깁니다. 앞다리로 그리드를 단단히 잡습니다. 또는 주로 사용하지 않는 손으로 마우스를 구속하고 측면 영역이 보이도록 합니다.
      2. 옆구리의 피부를 알코올 준비 면봉으로 소독합니다. 주사기의 내용물을 마우스의 피부 아래에 천천히 그리고 꾸준히 주입합니다.
      3. 바늘을 빼내고 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.
3. 종양 성장 모니터링
   1. 일주일에 한 번 쥐를 모니터링하여 만져지는 종양을 확인합니다.
   2. 종양이 측정 가능한 크기(약 50mm³)가 되면 캘리퍼를 사용하여 종양 치수를 기록합니다. 다음 공식을 사용하여 종양 부피를 계산합니다: (너비 x 너비 x 길이) / 2.
   3. 종양 부피가 약 1.5cm³(약 4-10주)에 도달하면 종양을 채취합니다. 이 종양은 이제 마우스 통로 1(MP1)이라고 불립니다.

결과

그림 1: 대체 이식 방법.(A) 종양은 덩어리, 슬러리 현탁액 또는 단세포 현탁액으로 처리할 수 있습니다. (B) 세 가지 방법 모두 생체 내에서 종양의 성장을 허용합니다. 여기에 표시된 것은 종양을 피하로 이식하고 이식 후 12일 후에 이미지화한 마우스입니다. (C) 세 가지 이식 방법 중 하나를 주입한 마우스의 종양 성장 곡선을 보여줍니다. N = 팔당 5개; 오차 막대는 표준 오류입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1M 헤페스	시그마-알드리치 코퍼레이션	고양이 # H0887-100ML
100x 펜스트렙	인비트로젠	고양이 # 15140163
HBSS-/- 1개(Ca++ 또는 Mg++ 제외)	클럽 메 드	고양이 # MT21-023-CV
2.5% 트립신	시그마-알드리치 코퍼레이션	고양이 # T4549-100ML	–20oC에서 10mL 부분 표본 보관
증권 시세	시그마-알드리치 코퍼레이션	고양이 # A9418-500G
클로르헥시딘	피셔 사이언티픽	고양이# 50-118-0313
콜라겐분해효소 IV (2,000 u/mL)	워 딩 턴	고양이 #4189	Collagenase IV 분말 스톡에서 HBSS - / - 메이크업 (Worthington # 4189, u / mg은 병에 표시되어 있으며 각 로트에 따라 다름); 동결 1
디엠소	시그마-알드리치 코퍼레이션	고양이 # C6295-50ML
DNase	시그마-알드리치 코퍼레이션	고양이 # D4527
EGTA (에틸렌 글리콜 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N'N'- 테트라 아세트산)	머 크	고양이 # 324626.25
FBS(증권 시세	INVITROGEN 생명 기술	고양이 # 16000-044
곰팡이 구역	INVITROGEN 생명 기술	고양이 # 15290-018
겐타마이신	피셔 사이언티픽	고양이 # BW17518Z
이소플루란	HENRY SCHEIN 동물 건강	고양이 # 050031
라이보비츠의 L15 미디어	인비트로젠	고양이 # 21083027
마트리겔	코 닝	고양이 # 354230	인공 세포외 기질
멜록시캠	HENRY SCHEIN 동물 건강Equisition # ::Henry Schein	고양이 # 025115	진통제로 1-5mg/kg,
NOD/SCID/IL2-수용체 null(NSG) 마우스	위스타 연구소, 동물 시설		번식
PVA(폴리비닐 알코올)	시그마-알드리치 코퍼레이션	고양이 # P8136-250G
RPMI 1640 미디엄(Mod.) 1X(L-글루타민 포함)	피셔 사이언티픽	고양이# MT10041CM
메스	깃털	고양이 # 2976-22
상처 클립	마이크론	고양이 #427631

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