행잉 드롭 방법(Hanging Drop Method): 3D 흑색종 스페로이드를 생성하는 기술

초록

출처: Müller, I. et al., 3D 유기형 흑색종 스페로이드 스킨 모델. J. Vis. 특급 (2018년)

이 동영상은 흑색종 세포를 이용하여 행잉 드롭 방식으로 3차원 스페로이드를 생성하는 기술에 대해 설명합니다. 생성된 체외 3차원(3D) 유기형 흑색종 스페로이드 모델은 악성 흑색종의 생체 내 구조를 묘사할 수 있으며 종양 내 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

1. Hanging Drop 방법을 통한 3D 흑색종 스페로이드 생성

1. 10% FCS를 함유한 RPMI를 사용하여 일반 프로토콜에 따라 흑색종 세포(예: 451-LU 또는 관심 흑색종 세포주)를 배양합니다.
   1. 유사한 크기와 품질의 흑색종 스페로이드를 생성하려면 PBS에서 흑색종 세포를 세척하고 PBS의 1x 트립신-EDTA 5mL를 T175 세포 배양 플라스크의 세포에 첨가한 다음 실온(RT)에서 3-5분 동안 배양합니다. 5 mL RPMI/10% FCS를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 혈구계에서 계수하여 측정된 10,000 cells/mL의 최종 농도에서 RPMI/FCS에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
2. 전자 멀티 피펫을 사용하여 40 x 25 μL(= 250 cells)의 세포 현탁액을 멸균 비접착 세포 배양 접시(Ø 10 cm)의 뚜껑 내부 표면에 점착시킵니다. 빠르지만 부드러운 움직임으로 뚜껑을 돌려 5mL PBS가 들어 있는 각 세포 배양 접시에 놓습니다.
   1. 사용된 세포 유형에 따라 10-14일 동안 37°C 및 5% CO₂의 세포 인큐베이터에서 "매달려 있는 드롭 디쉬"를 배양합니다.
      메모: 전이성 흑색종 성장기의 세포는 일반적으로 방사상 성장기 또는 수직 성장기에서 파생된 흑색종 세포에 비해 더 빠르게 성장하고 행잉 드롭에서 더 단단한 스페로이드를 형성합니다. 개별 평가를 위해 쌍안경 또는 광학 현미경(4X 배율)으로 스페로이드 성장을 관찰합니다. 일반적으로 스페로이드는 쌍안경 또는 광학 현미경(4X 배율)으로 48시간 후에 검출할 수 있습니다. 10-14일이 지나면 확대 장치 없이 볼 수 있습니다.
3. 최초 방울 발견 후 5일 후, 각 방울에 10μL의 새로운 RPMI/10% FCS 배지를 추가합니다. 그 후, 격일로 10μL의 배지를 교환합니다. 이 단계에서 전자 디스펜서를 사용하면 매우 유용합니다.
4. 세포 유형에 따라 10-15일 후에 스페로이드를 수확합니다. PBS로 매달린 드롭 세포 배양 접시의 뚜껑에서 스페로이드를 조심스럽게 헹굽니다. 10-20개의 스페로이드를 멸균 비접착 세포 배양 접시에 수집합니다. 파스퇴르 피펫으로 과도한 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
   메모: 배양 기간은 흑색종 세포가 처음 유래되었을 때 흑색종 세포의 종양 성장 단계에 따라 달라지며, 예를 들어 451-LU 세포에서 유래한 스페로이드는 행잉 드롭에서 배양한 후 12일 이내에 직경이 약 500μm까지 성장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
태아 혈청 알부민(FCS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10270106	세포 배양 배지에 10% 추가
트립신-EDTA	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	25300054	PBS에서 1X 희석
RPMI	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	61870010	흑색종 세포주 배양용

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