유기형 전체 피부 재구성 생성: 인간 피부 샘플을 사용하여 3D 피부 모델을 구축하는 절차

초록

출처: Müller, I. et al. 3D 유기형 흑색종 스페로이드 피부 모델입니다. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 흑색종 진행을 연구하기 위해 체외 3D 유기형 피부 재건을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 피부 모델은 생체 내 장기의 구조와 다세포 복잡성을 모두 모방합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 표피에서 원발성 각질 세포의 분리

1. PBS로 표피 조직을 세척합니다. 표피를 더 작은 조각(1mm²)으로 자르고 50mL 원뿔형 튜브에 모읍니다. 10mL 1x Trypsin-EDTA(37°C로 예열)를 넣고 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 2분마다 조직 현탁액을 소용돌이칩니다.
2. 1mL의 송아지 태아 혈청(FCS)을 첨가하여 효소 반응을 중단합니다. 10mL 플라스틱 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 4분 동안 세포를 재현탁합니다. 거품과 거품 형성을 피하십시오.
3. 새로운 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓인 세포 스트레이너(공극 크기 100μm)에 세포 현탁액을 피펫하고 5mL PBS로 3번 헹굽니다. 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 1%(v/v) 겐타마이신을 함유한 2-6mL 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 혈구계에서 세포 수를 계수하여 수동으로 세포 수를 측정하고 6 x 10⁵ 세포를 T75 세포 배양 플라스크에 시딩합니다.

2. 진피로부터 1차 섬유아세포의 분리

1. 피부 조직을 더 작은 조각(1mm²)으로 자르고 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 10mL 콜라겐분해효소 용액(PBS⁺의 경우 5U/mL)을 추가하고 37°C의 수조에서 45분 동안 배양합니다.조직 조각과 세포의 혼합물을 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
2. 4.5g/L 포도당과 L-글루타민을 함유한 10mL DMEM으로 세포 펠릿을 두 번 세척하되 L-피루베이트는 포함하지 않습니다. 마지막으로, 1%(v/v) 겐타마이신과 10% FCS를 함유한 DMEM 2mL에 조직 조각을 재현탁합니다. T25 세포 배양 플라스크에 옮기고 37°C 및 5% CO₂의 세포 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   참고: 부피가 작으면 섬유아세포가 조직 파편에서 이동할 수 있고 배양 플라스크에 부착되도록 합니다.
3. 다음날 아침, 6mL DMEM/Gentamycin/FCS를 더 추가하고 세포가 80-90% 포화도에 도달할 때까지 37°C에서 2-3일 동안 배양합니다.

3. Organotypic Full Skin Reconstructs의 피부 구획 생성

1. 24웰 플레이트에 배치된 24웰 세포 미세다공성 멤브레인 인서트(기공 크기 8μm)를 사용하여 피부 모델을 생성합니다.
   메모: 매달려 있지만 서있는 인서트는 나중에 공기-액체 배양을 위해 6웰 플레이트에 배치되므로 사용하지 마십시오.
2. 겔 중화 용액(GNL)과 MM 및 내피 성장 배지(EGM)라고 하는 배양 배지를 준비합니다. 응고를 방지하기 위해, 콜라겐 유형 I (보통 쥐 꼬리, 0.02 N 아세트산에 3.5-4 mg / mL)을 RT에서 겔화되기 시작하기 때문에 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
3. GNL에서 삽입당 1 x 10⁵ 섬유아세포를 다시 현탁하고 500 μL/삽입의 최종 부피에서 1:3의 비율로 세포 현탁액과 콜라겐을 빠르게 혼합합니다. 거품이 피부 재구성의 질을 손상시킬 수 있으므로 거품 형성을 방지하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫
팅하여 혼합하십시오.
4. 개별 피부 젤이 멸균 후드에서 30분 동안 RT에서 매체 없이 유지하여 가라앉을 수 있도록 합니다. 그 후, 4.5g/L 포도당, 1% L-글루타민, 10% FCS를 함유하고 L-피루브산이 없는 DMEM으로 각 젤을 덮고 37°C에서 밤새 배양합니다.

4. Organotypic Full Skin Reconstructs의 표피 구획 생성

1. 다음날, 진피 겔에서 배지를 제거하고 37°C에서 2시간 동안 EGM 배지(10% FCS, 1% PenStrep, 10mg/mL 겐타마이신)로 평형을 이룹니다.배지를 회수하고 진피 겔 위에 100μL EGM에 재현탁된 1 x 10⁵ 각질 세포를 조심스럽게 파종합니다.
2. 각질 세포가 피부 구획에 부착될 수 있도록 37°C에서 1.5시간 동안 재건물을 배양합니다.
   메모: 이 배양 시간 동안 겔은 섬유아세포에 의한 수축으로 인해 수축하기 시작하여 인서트 벽에서 적어도 부분적으로 분리됩니다.
3. 약 800μL EGM으로 피부 등가물을 덮고 작은(흰색) 피펫 팁으로 인서트 벽에서 잔류 겔을 조심스럽게 제거합니다. EGM에 담근 피부 등가물을 37°C, 5% CO₂의 세포 배양기에서 7일 동안 배양하고 격일로 배지를 교체합니다.
   메모: 이 기간 동안 피부 등가물이 크게 줄어들 것입니다.

5. 유기형 전체 피부 재건의 공기-액체 배양

1. 8일차에 각 삽입물을 6웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰에 1.2-1.4mL의 MM 배지만 추가하여 피부 재구성이 웰 바닥에서 배지로 공급되지만 배지로 덮이지 않도록 합니다.
   메모: 공기-액체 계면에서 배양하면 표피 부분의 성층화와 완전한 각질층(각질층)의 형성이 가능합니다.
2. 다음 10-17일 동안 섹션 5.1에 명시된 대로 격일로 매체를 변경합니다. 이 기간 동안 필요에 따라 약물 또는 기타 자극을 배지에 첨가하십시오. 추가 분석(예: 면역조직화학 분석)을 위해 곡선 핀셋을 사용하여 미세 다공성 멤브레인 삽입물에서 전체 피부 재구성을 조심스럽게 제거합니다(그림 1).

결과

그림 1: 3D 유기형 피부의 배양은 매체 및 공기-액체 계면에서 침수된 피부를 재구성합니다. 0일차에는 원발성 각질세포가 콜라겐 I형 기질에 내장된 원발성 섬유아세포로 구성된 진피 구획 위에 파종됩니다. 3D 스킨 재구성은 EGM으로 7일 동안 잠기면서 배양한 상태를 유지하고 인서트 벽에서 분리하고 수축을 시작합니다. 8일째에 삽입물은 6-well로 옮겨지고 표피 성층화를 허용하기 위해 공기-액체 계면에서 배양됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
태아 혈청 알부민(FCS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10270106	세포 배양 배지에 10% 추가
트립신-EDTA	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	25300054	PBS에서 1X 희석
DMEM을 참조하십시오.	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	41965062	1차 섬유아세포(primary fibroblast)의 배양을 위해
디스플레이	Gibco life 기술	17105041	2U/ml, PBS에 용해
콜라겐 타입 I	BD 바이오사이언스	354249	보통 쥐 꼬리에서, 농도는 3.5-4 mg/ml이어야 합니다
24웰 인서트 Nunclon	눕크	140629	8 μm 기공 크기; 인서트를 매달지 않고 서서 사용
세포 스트레이너	BD 팔콘	제352360	황색
겐타마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15750060	PBS에 디졸브
Keralife 각질 세포 매체	세포 시스템		FCS 또는 항생제를 추가하지 마십시오.
콜라겐 분해 효소	세르바	17454	NB4 표준 등급
청소년 인간 각질 세포	세포 시스템	FC-0007	어린 포피에서 자신의 준비에 대한 대안
청소년 인간 섬유아세포	세포 시스템	FC-0001	어린 포피에서 자신의 준비에 대한 대안
증권 시세	Gibco life 기술	제13247-051	EGM 배지 생성을 위해서만 10ng/ml 추가
염화칼슘	머크 케미컬	2381	EGM 생성의 경우 1.9mM, MM 매체의 경우 3.8mM 추가
셀렌산	알파 에자르	18851	EGM 및 MM 배지 생성을 위해 53nM 추가
인슐린	릴리	HI0219 험 펜 3ml 100 EI/ml	EGM 및 MM 배지 생성을 위해 5μg/ml 추가
에탄올아민	시그마-알드리치	E-0135 (영문	EGM 및 MM 매체 생성을 위해 0.1mM 추가
P-에탄올아민	시그마-알드리치	P-0503	EGM 및 MM 매체 생성을 위해 0.1mM 추가
홀로-트랜스페린	시그마-알드리치	T-0665	EGM 및 MM 배지 생성을 위해 5μg/ml 추가
트리요오드티로닌	시그마-알드리치	T-6397	EGM 및 MM 매체 생성을 위해 20pM 추가
하이드로코르티손	시그마-알드리치	H-088816	EGM 및 MM 배지 생성을 위해 0.4μg/ml 추가
프로게스테론	시그마-알드리치	P-8783	EGM 매체 생성에만 10nM 추가
헤페스	시그마-알드리치	H-3784	EGM 및 MM 배지 생성을 위해 15mM 추가
세린	시그마-알드리치	에스-4311	EGM 및 MM 배지 생성을 위해 1mM 추가
염화콜린	시그마-알드리치	C-7017	EGM 및 MM 매체 생성을 위해 0.64mM 추가
디프씨에스	시그마-알드리치	F-0392 로트 086K0361	EGM 및 MM 매체 생성을 위해 2% 추가
아데닌	시그마-알드리치	A-9795	EGM 및 MM 매체 생성을 위해 0.18mM 추가
L-글루타민	프로모셀	C-42209	EGM 및 MM 매체 생성을 위해 7.25mM 추가
스트론튬 클로라이드	시그마-알드리치	255521	EGM 및 MM 배지 생성을 위해 1mM 추가

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