실험적 전이성 흑색종 마우스 모델: 폐 내 흑색종 세포의 전이 가능성을 연구하기 위한 플랫폼

초록

출처: Joshua J. Timmons et al. 폐에서 전이 가능성을 확인하기 위해 syngeneic murine 흑색종 세포를 주입합니다. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오에서는 마우스 모델의 꼬리 정맥을 통해 흑색종 세포를 정맥 주사합니다. 흑색종 세포는 순환계를 통해 더 멀리 이동하면서 멀리 떨어진 미세환경에 적응하고 폐와 같은 장기에 전이를 일으킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. B16-BL6 세포의 준비

1. 37도 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 제거하고 멸균 후드에 넣습니다. 플레이트는 B16-BL6 쥐 흑색종 세포와 약 70% 융합되어야 합니다. 더 큰 합류점은 세포의 전이 가능성을 변경할 수 있습니다.
2. 플레이트당 0.05% 트립신-EDTA 1mL를 추가하고 1분 동안 그대로 둔 다음 트립신-배지 용액을 흡인합니다.
3. 플레이트당 1mL의 트립신을 추가하고 플레이트를 10분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
4. 플레이트를 인큐베이터에서 멸균 후드로 옮긴 후 각 플레이트에 무혈청 Rosewell Park Memorial Institute(RPMI) 배지 4mL를 추가합니다.
5. 멸균된 전동 피펫으로 세포를 수집합니다. 끝을 아주 약간의 각도로 눌러 플레이트 바닥에 대고 세포를 배출하여 세포를 분해합니다. 여러 번 반복하여 세포 덩어리가 적절하게 분리되도록 하면 배출 바늘이 막힐 수 있습니다. 회수하여 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
6. 혈구계를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. B16-BL6 세포의 총 수를 일정하게 유지하면서 0, 0.065, 0.015, 0.25 및 0.50만 cells/mL의 최종 농도에 도달하는 데 필요한 무혈청 RPMI의 부피를 측정합니다.
7. 50mL 튜브의 배지를 15mL 코니컬 튜브로 균등하게 분취합니다. 원뿔형 튜브를 2,250 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 미디어를 디캔팅하십시오. 적절한 부피의 무혈청 RPMI를 추가하고 혈구계를 통해 원하는 세포 밀도를 확인합니다. RPMI를 추가하거나 그에 따라 더 작은 부피로 회전 및 재현탁하여 밀도를 조정합니다.
8. 각 세포 현탁액 500μL를 얼음 위의 라벨링된 1.8mL 튜브에 분취합니다.

2. 꼬리 정맥 주입

1. 암컷 C57BL/6 마우스(6-8주령), 그룹당 5마리의 마우스를 구입하십시오. 쥐가 적응할 때까지 며칠 동안 기다립니다.
2. 꼬리를 잡고 있는 마우스를 잡고 뒤쪽부터 마우스 고정 장치로 안내합니다. 몸통을 구속기의 메인 챔버에 넣고 꼬리를 바깥쪽에 두고 마우스를 구속 장치의 끝으로 당깁니다. 재스트레이너 플런저를 삽입하고 마우스가 고정될 때까지 계속 누릅니다.
3. 측면 꼬리 정맥 중 하나가 위쪽을 향하도록 마우스를 90도 회전합니다. 알코올 패드를 사용하여 쥐의 꼬리 측면, 특히 꼬리 정맥이 가장 잘 보이는 곳을 세게 닦아줍니다.
   메모: B57BL/6J 마우스에서 효과적인 꼬리 정맥 시각화를 위해서는 좋은 조명이 필수적입니다. 온열 램프나 온열 수술 패드는 필수는 아니지만 꼬리 정맥의 부피를 늘리는 것도 도움이 됩니다.
4. 멸균 배양 후드에서 200만 cells/mL 튜브에서 300μL의 세포 배양 배지를 수집합니다. 바늘을 뒤집어 측면을 튕기고 플런저를 밀어 주사기에서 기포를 배출합니다. 배양액-RPMI를 배출하여 최종 부피가 250μL가 됩니다.
5. 주로 사용하지 않는 손으로 마우스 꼬리를 뻗습니다. 주로 사용하지 않는 손의 집게손가락으로 꼬리의 근위 끝을 들어 올리고 엄지 손가락으로 꼬리의 원위 부분을 눌러 꼬리를 잡습니다.
   메모: 이런 식으로 꼬리 정맥은 구속 표면과 평행한 측면 위치에 유지되며 꼬리의 더 말단 부분에서 합동 진입이 가능합니다.
6. 바늘을 꼬리 정맥에 바늘을 말단 끝을 향해 1분 정도 아래쪽 각도로 삽입한 다음 추가 삽입 시 꼬리 정맥의 각도와 일치하도록 바늘을 조정합니다(바늘에 비해 주사기의 플런저 끝을 내림).
7. 바늘을 꼬리 정맥에 약 1cm 정도 삽입합니다. 삽입 후 바늘을 안정적으로 유지하면서 플런저를 밀기 시작합니다.
   메모: 바늘이 꼬리 정맥에 있고 바늘 끝이 막히지 않은 경우 매체는 정맥으로 방해받지 않고 흘러야 합니다.효과적인 주사는 정맥에서 혈액이 제거되는 것이 특징입니다. 저항이 있거나 주사 부위에 거품이 형성되기 시작하면 바늘을 제거하고 꼬리 정맥을 따라 더 가까운 위치에서 다시 시도하십시오.
8. 정맥에서 바늘을 제거하고 버리십시오. 출혈을 멈추기 위해 입구 부위에 거즈를 대십시오.
9. 고정장치에서 플런저를 제거하고 마우스를 수용 케이지에 넣습니다.
10. 다른 모든 농도에 대해 반복합니다.
    메모: 폐 병소 확립에는 약 2-3주가 소요되며, 세포주와 원하는 병소 크기에 따라 변동성이 있습니다. 그 동안, 생쥐는 과도한 헐떡임과 같은 조기 안락사를 정당화할 수 있는 증상이 있는지 모니터링해야 합니다.

3. 폐 병소 계산

1. 마우스를 CO₂ 챔버에 넣고 100분 동안 분당 챔버 부피의 30-10%로 주입된 2% CO₂에 노출시켜 안락사시킵니다.
2. 스티로폼에 마우스를 펼칩니다. 수술용 가위를 사용하여 흉골을 따라 외과적 절개를 만듭니다.
3. 흉골 절개 부위 위쪽에서 마우스의 어깨 쪽으로 가지를 뻗어 흉곽을 노출시키는 두 개의 추가 절개를 만듭니다.
4. 흉골의 측면을 따라 각각 두 개씩 절개하여 몸통에서 흉곽을 제거하여 폐와 심장을 노출시킵니다.
5. 수술용 핀셋으로 심장을 잡고 식도와 기관을 잘라 심장과 폐를 쥐로부터 해방시킵니다. 더 나은 시각화를 위해 10X 배율로 해부 현미경 아래에 놓습니다.
6. 심장과 폐를 분리하고 흉선을 제거하고 두 개의 폐만 남깁니다.
7. 폐를 해부 범위 아래에 두고 폐 병소를 세기 시작합니다. 각 초점은 폐 표면에 원형의 갈색 돌출부로 나타나야 합니다.
   1. 생쥐 간의 일관성을 위해 엽 표면의 foci 수를 세고 그 엽을 반전시킵니다. 4개의 엽을 각각 개별적으로 수행하면 더 쉽게 계산할 수 있습니다.
8. IHC를 수행하는 경우 폐를 저장하고 고정하고, 그렇지 않으면 잔해를 폐기하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립신	코 닝	MT25052CV
RPMI 1640 미디엄	코 닝	MT15040CM
위상 Contraast 혈구계	하우저	02-671-54
Micro-Fine IV 인슐린 주사기	BD (영어)	14-829-1일
멸균 알코올 준비 패드	피셔브랜드	전화: 22-363-750
마우스 구속 장치	브레인트리 사이언티픽	NC9999969	억제장치 선택은 마우스의 나이/크기에 따라 다릅니다
히팅 패드	해리 샤인	NC0012697	선택적