HCR-DNA FISH: 감염된 세포에서 바이러스 DNA를 검출하기 위한 형광 현장 혼성화 기술

초록

출처: Wei Liu et al., Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).

이 비디오에서는 MCPyV 비리온에 감염된 세포를 현장 혼성화 연쇄 반응을 통해 MCPyV 특이적 게놈을 검출했습니다. 또한 DNA-HCR 기술을 FISH와 결합하여 감염된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 시각화했습니다.

프로토콜

1. 감염

1. DMEM에서 10%의 태아 송아지 혈청, 1%의 비필수 아미노산 및 1%의 L-글루타민으로 1차 인간 피부 섬유아세포를 유지합니다. 합류점에 도달하면 아래로 회전하지 않고 섬유아세포를 1:4로 분할합니다.
   메모: MCPyV 감염 효율을 높이려면 도금 시 활발하게 분열하는 5계와 12호 사이의 1차 섬유아세포를 사용합니다.
2. 인간 진피 섬유아세포를 감염시키려면 배지를 흡인하고 DPBS로 세포를 세척합니다.
3. 0.05% 트립신-EDTA 1mL를 접시에 넣고 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
4. 현미경으로 세포가 접시에서 떨어지는지 확인하십시오.
5. MCPyV 감염을 자극하는 20ng/mL EGF, 20ng/mL bFGF 및 3μM CHIR99021이 모두 포함된 DMEM/F12 배지 10mL를 접시에 추가하고 세포 용액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
6. 180 x g에서 2분 동안 세포를 스핀다운하고 상층액을 버립니다. 20ng/mL EGF, 20ng/mL bFGF 및 3μM CHIR99021을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 mL당 2-4 x 10⁴ 세포로 세포를 재현탁합니다.
7. 1mg/mL 콜라겐분해효소 IV형이 보충된 세포 현탁액 200μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 파종합니다. 얼음 위에서 MCPyV 비리온 스톡을 해동합니다. 감염될 세포 2,500-5,000개당 요오딕산올 1μL당 MCPyV 비리온 9개 등가물 10개를 추가합니다.플레이트의 측면을 가볍게 두드리고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.
8. 37 ° C에서 5 % CO₂ 에서 48-72 시간 동안 배양 한 후 각 웰에 20 % FBS를 첨가하십시오.
9. 감염이 37-5시간 동안 5% CO₂에서 96°C로 진행되도록 합니다.

2. 현장 DNA-HCR

1. PBS에서 4% PFA로 커버슬립에서 배양된 세포를 10분 동안 고정합니다. PBS로 커버슬립을 두 번 세척한 다음 70% 에탄올로 처리하여 하룻밤 동안 4°C에서 세포를 투과시킵니다.
   메모: 고정 샘플은 며칠 동안 이 상태로 유지될 수 있습니다.
2. 에탄올을 프로브 혼성화 완충액으로 대체하고 RT에서 60분 동안 배양하여 시료를 사전 혼성화합니다.
3. 사전 혼성화 단계가 끝나기 30분 전에 1:500으로 프로브(혼성화 완충액)에 프로브(1μM)(표 1)를 희석하고 45°C에서 배양합니다.
4. 배양이 끝나면 현미경 슬라이드의 커버슬립당 희석된 프로브 혼합물 ~10 μL를 피펫팅합니다. 커버슬립을 세포 면이 아래로 향하게 하여 혼성화 프로브 혼합물의 해당 방울에 놓습니다. 커버 슬립의 가장자리와 뒷면을 충분한 양의 고무 시멘트로 슬라이드에 밀봉합니다.
5. 히트 블록의 평평한 면에 슬라이드를 설정하여 94°C에서 3분 동안 프로브가 추가된 슬라이드를 가열합니다. 슬라이드를 가습 챔버로 옮기고 45°C에서 밤새 배양합니다. 간단한 가습실을 만들려면 멸균 종이 타월에 dH₂O를 가볍게 적셔 고무 개스킷으로 밀봉하는 플라스틱 용기 바닥에 놓습니다.
   메모: 가열하는 동안 고무 시멘트가 잠시 거품을 일으킬 수 있습니다. 그러나 밀봉이 파손되지 않도록 하십시오.
6. 집게로 고무 시멘트를 조심스럽게 벗겨내고 커버 슬립 셀 쪽을 위로 향하게 하여 24웰 플레이트의 웰에 다시 놓습니다. RT에서 프로브 세척 버퍼로 커버슬립을 세 번 세척합니다.
7. RT에서 증폭 완충액(24웰 플레이트의 200μL)에서 커버슬립을 30-60분 동안 배양합니다.
8. 한편, 별도의 PCR 튜브에서 프로브(표 1)를 인식하는 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 헤어핀을 각각 94°C로 90초 동안 가열하고 30분 동안 RT로 냉각하면서 빛으로부터 보호하여 어닐링합니다. 증폭 버퍼에 두 개의 헤어핀을 각각 1:50의 희석액으로 혼합합니다.
9. 24웰 플레이트 뚜껑의 열린 면 위에 파라핀 필름을 늘려 증폭 반응을 위한 표면을 만듭니다. 헤어핀/증폭 완충액 혼합물의 50-100 μL 방울을 각 커버슬립의 파라핀 필름에 피펫팅합니다. 집게를 사용하여 사전 증폭 용액에서 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 다공성 일회용 물티슈의 가장자리를 만져 커버슬립을 건조시키고 세포 면이 아래로 향하게 하여 증폭 방울 위에 놓습니다.
10. 커버슬립을 고정하는 플레이트 뚜껑을 가습실에 넣고 어둠 속에서 RT에서 밤새 배양합니다.
11. 커버 슬립을 다시 한 번 우물에 되돌립니다. RT에서 1시간 동안 0.5μg/mL DAPI를 포함하는 5x SSCT[5x 염화나트륨 구연산나트륨(SSC) 0.1% Tween 20]으로 샘플을 배양합니다. RT에서 5x SSCT로 샘플을 두 번 세척합니다.
12. 현미경 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 도립 형광 현미경을 사용하여 세포를 분석하고 샘플을 이미지화합니다.

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MCPyV 프로브 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggaggaggaggaccaccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV 프로브 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttttt CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV 프로브 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV 프로브 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV 프로브 6	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV 프로브 7	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV 프로브 8	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggaccacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
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MCPyV 프로브 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCA
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HPV 프로브 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCacctcac
HPV 프로브 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggggggggccaagtgctgcctaataattattt CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV 프로브 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

표 1: 연구에 사용된 프로브.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
프로브 혼성화 버퍼	분자 기술
프로브 세척 버퍼	분자 기술
증폭 버퍼	분자 기술
Alexa 594 라벨 헤어핀	분자 기술	B4	빛으로부터 보호
파라포름알데히드	시그마	P6148