인간 피부 각질 세포 분리: 피부 샘플에서 1차 각질 세포를 배양하는 방법

초록

Johansen, C. et al. 성인 피부에서 1차 인간 각질세포의 생성 및 배양. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 효소 분해와 기계적 파괴 방법을 조합하여 인간 피부의 표피층에서 가장 두드러진 세포인 각질 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 선택적 성장 배지를 사용하여 다른 피부 세포 유형보다 각질 세포의 우선적 성장을 돕습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 인간 피부에서 각질 세포 분리

1. 먼저 DPBS에 0.25% 트립신과 0.1% 포도당으로 구성된 50mL 용액을 만듭니다. 용액을 혼합하고 여과하여 살균(0.2μm)합니다. RPMI-1640 + 2% FBS 용액 10mL, DPBS 50mL 및 각질세포 무혈청 배지(KSFM)를 준비합니다. KSFM 보충제와 250μL의 겐타마이신을 500mL의 KSFM에 첨가합니다. 사용하기 전에 용액을 37°C로 예열하십시오.
2. 성형 수술을 받는 건강한 성인 지원자의 피부를 수집합니다. 사용된 피부 샘플은 약 10cm x 15cm이지만 크기는 다양할 수 있습니다. 냉각 요소가 들어있는 스티로폼 상자에 피부 샘플을 운반하여 운송 중 피부를 시원하게 유지하십시오. 필요한 경우 피부 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다.
3. 멸균된 가위, 메스, 집게를 사용하여 피부 아래의 지방을 제거합니다.
4. 바늘을 사용하여 접시 위의 멸균 덮개에 피부 부분(약 10cm x 15cm)을 버클을 채웁니다. 먼저 마른 살균 거즈 패드로 피부를 청소합니다. 그런 다음 에탄올 70%가 함유된 멸균 거즈 패드를 사용하여 피부를 청소합니다.
5. 발 대패를 사용하여 피부 부분의 상층(표피)을 잘라내고 9cm 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 즉시 DPBS/트립신/포도당 용액 25mL(1.1단계에서 준비)를 페트리 접시에 추가합니다. 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.
6. 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 DPBS/트립신/포도당 용액을 제거하고 RPMI-10 + 1640 + 2% FBS를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
7. 두 개의 집게를 사용하여 이제 피부 부분의 표피와 피부 구획을 부드럽게 긁고 교반하여 표피 세포를 배지로 방출합니다.
8. 금속 필터(1mm 구멍 크기)를 통해 표피 세포 현탁액을 여과하고 50mL 튜브에 수집합니다. FBS가 없는 RPMI-1640 10mL가 들어 있는 50mL 튜브에 나머지 피부 절편을 추가하고 10초 동안 와류를 일으킵니다. 금속 필터를 통해 현탁액을 표피 세포 현탁액이 들어 있는 50mL 튜브로 여과합니다. 총 부피 50mL에 DPBS를 추가합니다.
9. 실온에서 450 x g에서 10분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
10. 상층액을 제거하고 세포 펠릿의 크기에 따라 37°C KSFM의 약 10mL에 표피 세포 펠릿을 재현탁합니다. 현미경으로 Trypan Blue 염색 방법을 사용하여 세포를 세십시오. 10cm x 15cm의 피부 절편에서 얻어지는 세포의 수는 약 50-100 x 10⁶ 세포입니다. 각 75 cm² 배양 플라스크에 8 x 10⁶ 세포를 12 mL의 37 °C KSFM과 함께 옮깁니다. 세포가 균일하게 분포되도록 배양 플라스크를 부드럽게 흔듭니다.
11. 습도 100%와 CO 5%의 37°C 인큐베이터에서 각질 세포를 배양합니다_.2. 2일 후, 일주일에 3회 매체를 교체하십시오. 배양액이 70-80% 융합될 때 계대 세포는 각질 세포의 증식 속도에 따라 약 2주가 소요됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
KSFM (영문	써모피셔 사이언티픽	제17005-034	세포 배양 배지
KSFM 보충제	써모피셔 사이언티픽	37000-015	KSFM용 보충제
디피에스	써모피셔 사이언티픽	14190-144	칼슘 및 가 없는 DPBS 마그네슘
디엠소	시그마-알드리치	D8418	디메틸 설폭사이드
겐타마이신	써모피셔 사이언티픽	제15710-049	세포 배양 배지 첨가제
살균 필터	싸토리우스	16534	기공 크기가 0.2 인 주사기 필터 μm의
트립신	시그마-알드리치	T7409	세포를 트립신화하는 데 사용
포도당	시그마-알드리치	G7528 (영문	-
RPMI-1640	써모피셔 사이언티픽	우편번호 61870-010	-
FBS(증권 시세	써모피셔 사이언티픽	16000044	트립신을 비활성화하는 데 사용됩니다.
집게	-	-	모든 회사의 겸자는 다음과 같습니다 사용
가위	-	-	모든 회사의 가위는 다음과 같습니다 사용
메스	스완 모튼	0501	모든 회사의 메스는 다음과 같습니다 사용
70% 에탄올	-	-	-
거즈 패드	노바메드	875420	모든 공급자의 거즈 패드는 수 있습니다. 사용되다
발 대패질	크레도 졸링겐	1510	모든 공급자의 발 대패는 할 수 있습니다. 사용되다
페트리 접시	증권 시세	93100	모든 공급자의 페트리 접시는 할 수 있습니다. 사용되다
금속 필터	-	-	자체 1mm 구멍 크기 금속 필터
75cm배양 플라스크 2개	증권 시세	156499	-
150cm배양 플라스크 2개	티피(TTP)	90151	-
0.05% 트립신-EDTA 용액	써모피셔 사이언티픽	제25300-062	같은 경우 세포를 트립신화하는 데 사용됩니다 패시징

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