흑색종 줄기세포 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 CD133 양성 및 음성 흑색종 세포를 얻는 방법

1. LS 컬럼을 이용한 CD133⁺ 및 CD133^- 흑색종 세포의 자기 세포 분류

1. PBS에서 2mM EDTA 및 5% FCS를 포함하는 MACS 버퍼를 준비합니다. 0.22μm Steritop-GP 필터 장치를 사용하여 반전 및 멸균 여과액 완충액을 혼합합니다. 냉각 버퍼를 4-8 °C로 만들고 사용하기 전에 가스를 제거하십시오.
2. Accutase, PBS 및 Quantum 263 매체를 37°C로 예열합니다.
3. 80%의 융합 세포를 PBS로 세척합니다. 적절한 양의 Accutase를 추가하고 세포가 배양 표면에서 분리될 때까지 배양합니다. Quantum 263 배지를 사용하여 50mL 튜브에 세포를 수집합니다.
4. 셀 수를 결정하고 300 x g 및 4-8 °C에서 5분 동안 필요한 수의 셀을 원심분리합니다. (Miltenyi의 프로토콜에 따르면 LS 컬럼당 최대 2x 10⁹ 셀을 로드할 수 있습니다. 세포주별 최적 수치를 결정해야 하며 상당히 낮을 수 있습니다.) 상층액을 완전히 흡인합니다.
5. 350 μL MACS 완충액으로 최대 1x 10⁸ 세포를 재현탁합니다(세포 수를 늘리려면 다음 모든 MACS 완충액, FcR 차단 시약, CD133/1-비오틴 및 항 비오틴 MicroBeads 부피를 그에 따라 스케일업).
6. 100μL FcR 차단 시약을 추가합니다.
7. 50μL CD133/1-비오틴을 추가합니다. 와류를 사용하여 잘 섞고 4-8 ° C에서 10 분 동안 배양합니다.
8. 10mL MACS 완충액과 원심분리기를 첨가하여 300 x g 및 4-8°C에서 5분 동안 세포를 세척합니다.상층액을 완전히 흡인합니다.
9. 세탁 단계(1.8)를 반복합니다.
10. 세포 펠릿을 400 μL MACS 완충액으로 재현탁합니다.
11. 100μL 항비오틴 MicroBead를 추가합니다. 와류를 사용하여 잘 섞고 4-8 ° C에서 15 분 동안 배양합니다.
12. 한편, 자기 분리를 위해 MACS 분리기를 준비합니다. QuadroMACS를 MACS 분리기 멀티 스탠드에 연결합니다. 컬럼 날개가 있는 LS 컬럼을 QuadroMACS의 자기장 앞쪽에 필요한 수만큼 삽입합니다. 사전 분리 필터(30μm 나일론 메쉬 포함)를 각 LS 컬럼에 배치하고 각 컬럼 아래에 적절한 수집 튜브(15mL 또는 50mL)를 놓습니다. 3mL MACS 완충액으로 헹궈 필터와 컬럼을 준비합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
13. 10mL MACS 완충액과 원심분리기를 첨가하여 300 x g 및 4-8°C에서 5분 동안 세포를 세척합니다.상층액을 완전히 흡인합니다.
14. 500μL MACS 버퍼로 세포를 재현탁하고 사전 분리 필터로 LS 컬럼에 세포 현탁액을 적용합니다.
15. 컬럼당 3mL MACS 버퍼로 3회 세척합니다. 컬럼 저장소가 비어 있는 경우에만 새 버퍼를 추가합니다.
16. 수집된 총 폐수에는 표지되지 않은 CD133^- 세포 분획이 포함되어 있습니다.
17. Pre-Separation Filter를 버리고 분리기에서 컬럼을 제거한 다음 적절한 수집 튜브에 놓습니다.
18. 5mL MACS 완충액을 도포합니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 라벨링된 CD133⁺ 세포를 즉시 세척합니다.
19. 음수 분획의 순도를 높이려면 QuadroMACS에 삽입된 새로운 평형 LS 컬럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 폐수에는 CD133^- 분획이 포함되어 있습니다.
20. 열을 버립니다.