화학적 유도 2단계 피부 발암 모델: 피부암의 실험적 생체 내 마우스 모델

초록

출처: Vähätupa, M. et al. 디메틸벤즈[a]안트라센 및 12-O-테트라데카노일 포르볼-13-아세테이트(DMBA-TPA)를 사용한 화학적 유도 피부 발암 모델. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 화학 물질의 국소 적용에 의한 종양 시작을 연구하기 위해 2단계 피부 발암을 유도하는 절차를 설명합니다. 첫 번째 단계에서는 줄기세포에 돌연변이를 일으켜 종양 형성을 시작하는 마우스 모델의 피부에 돌연변이 유발 물질인 DMBA를 적용한 다음 피부 유두종 형성을 가속화하는 성장 자극제인 TPA를 적용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 실험 동물, 시약 및 장비

1. 연령과 성별이 일치하는 마우스를 사용하십시오. 생후 7-9주에 연구를 시작하는데, 대부분의 생쥐의 피부는 그 나이 무렵에 휴지기 상태(휴지기)에 있기 때문입니다.
2. 연구 기간 동안 동물의 행동을 관찰하고 수컷에게 자주 발생하는 싸움이 발생하면 동물을 따로 수용하십시오. 싸움은 종양 형성을 촉진하는 피부에 상처를 유발할 수 있습니다. 암컷 마우스는 덜 공격적인 행동으로 인해 선호됩니다. 일반적인 실험 그룹 크기는 그룹당 8-20마리 사이입니다.
   메모: 이전 연구에서 나타난 생물학적 분산을 기반으로 한 거듭제곱 계산은 충분히 큰 그룹 크기를 선택하는 데 도움이 됩니다. 이 기사에서 예시로 사용된 균주에는 Balb/c 및 C57BL/6이 포함됩니다. 그러나 SENCAR 및 FVB와 같은 다른 많은 마우스 균주가 DMBA-TPA 모델 및 Wistar 및 Sprague-Dawley 쥐와 함께 사용되었습니다. 연구를 시작하기 전에 국가 또는 지역 동물 작업 위원회의 면허가 필요합니다. 일반적인 복지 고려 사항 외에도 모델별 평가변수는 일반적으로 편평세포암(SCC) 및 피부 감염입니다. 아세톤에 종양 유발 화학 물질을 바른 후 가려움증으로 인한 피부 긁힘이 일반적이지만, 그렇지 않으면 동물은 불편 함의 징후를 보이지 않아야합니다. 규칙적으로(예: 한 달에 2회) 체중을 재면 동물의 복지를 평가하는 데 도움이 됩니다.
3. 아세톤으로 희석된 DMBA와 TPA를 사용하십시오. DMBA의 작업 농도는 250g/L입니다. 동물 1마리의 투여량은 아세톤 200μL에 DMBA 50μg입니다. TPA의 재고 농도는 125g/L이고 처리 농도는 25g/L입니다. 동물 1마리에 대한 TPA 선량은 아세톤 200μL에 5μg입니다.
   주의: DMBA는 삼키면 해롭고 암을 유발할 수 있습니다. 아세톤은 빠르게 증발하며 가연성입니다. 현기증을 일으키고 눈을 자극할 수 있습니다. 호흡 마스크를 사용하거나 진공 흐름 아래에서 작업하십시오. 이러한 화학 물질을 취급한 후에는 장갑을 교체하십시오. 개별적으로 환기되는 케이지는 마우스의 사육 중 화학 물질의 확산을 방지합니다. 도포 후 DMBA를 취급하는 데 사용되는 피펫 팁을 모아 위험 폐기물로 폐기하십시오.
   메모: DMBA는 빛으로부터 보호되어야 합니다. 희석된 TPA는 -20°C에서 보관하며, 가급적이면 빛으로부터 보호됩니다.
4. 저울, 털, 피펫 및 적절한 크기의 팁용 일반 면도기, 일반 자, 디지털 카메라, 메모장, 유두종을 기록하기 위한 펜 또는 컴퓨터, 흡입 마취 시스템 또는 후면 상단에 구멍이 있는 마우스 억제기, 마우스 희생을 위한 이산화탄소 마취 시스템을 조달하십시오.

2. 피부 유두종 유도 및 프로모션

1. 등 피부를 면도하고 동물의 무게를 잰다. 나중에 필요할 때마다 피부를 면도하되 화학 물질에 노출된 경우에는 면도하지 마십시오.
   메모: 유두종 주변을 면도할 때 주의하고 피부에 상처를 입히지 마십시오. 2주마다 각 동물의 체중을 측정하여 잠재적인 체중 감소를 확인하십시오.
2. 털을 면도한 후 48시간 후에 피펫을 사용하여 면도한 부위에 200μL의 아세톤에 50μg의 DMBA를 국소적으로 도포합니다. 필요한 경우 광 흡입 마취 또는 마우스 구속기를 사용하여 동물을 제지하십시오.
3. 7일 후 첫 번째 TPA 용량을 투여합니다. 아세톤 200μL에 5μg의 TPA를 피펫으로 일주일에 2회, 가급적이면 월요일과 목요일 또는 화요일과 금요일에 국소적으로 도포합니다.
4. 매주 유두종을 세고, 기록하고, 사진을 찍습니다. 직경이 1mm보다 큰 만져질 수 있는 종괴는 1주일 이상 지속되면 유두종으로 간주됩니다. 각 유두종을 지도에 표시하고 매주 크기를 나열하여 디지털 사진을 저장하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
7,12- 디메틸 벤츠 [a] 안트라센 (DMBA)	시그마	D3254-100MG	삼키면 유해하며 암을 유발할 수 있습니다. 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
아세톤	시그마	1000141011	빠르게 증발하고 인화성이 있습니다.
수의사 1000 mg/g	Piramal Critical Care Limited		흡입을 위한 액체 이소플루란
배터리로 작동되는 클리퍼 Isis	알버트 Kerlb GmbH	GT421	털을 깎기 위해
CONTRA플루란-레스트가스 필터	제오시스 GmbH		마취용
리넨 넥스 네이처 N1030 자 30cm	Staples 비즈니스 어드밴티지	60383	유두종 측정용
Tacta 피펫 100-1000 ul	싸토리우스	LH-729070
Tacta 피펫 20-200 ul	싸토리우스	LH-729060
Phorbol 12-myristate 13-acetate 일명 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)	엔조	BML-PE160-0001
메카소프트	메칼라시	23008	테이블 커버
정밀 밸런스 PLJ-C/PLJ-G	케른 & 손 GmbH	PLJ 600-3CM
마우스(Balb/c JRj)	Janvier 연구소		다른 균주도 가능
마우스(C57BL/6JRj)	Janvier 연구소		다른 균주도 가능
Panasonic Lumix DMC-FS5 디지털 카메라	파나소닉

시리즈 년