출처: Murphy, B. M. et al. 1차 쥐 멜라닌 세포 및 섬유아세포 배양의 빠른 생성. J. Vis. 특급 (2019년)
이 비디오는 출생 후 새끼 쥐의 피부에서 멜라닌 세포와 섬유아세포를 동시에 분리하고 배양하는 빠른 방법을 설명합니다. 이러한 세포는 피부 세포 생물학, 상처 치유 및 흑색종을 연구하기 위해 체외에서 유지 및 조작할 수 있습니다.
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방법 논문
1차 쥐 멜라닌 세포 및 섬유아세포의 빠른 배양: 전체 쥐 피부 샘플에서 멜라닌 세포 및 섬유아세포 분리
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2023년 4월 30일
이 논문에서
초록
프로토콜
동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 멜라닌 세포 및 섬유 아세포 분리
- 0-4일 된 수컷 및/또는 암컷 C57Bl/6J 새끼를 참수하여 안락사시키고 수술용 가위를 사용하여 안락사된 쥐의 사지를 제거합니다.
- 층류 캐비닛에서 70% 에탄올이 함유된 멸균 페트리 접시에 각 마우스의 트렁크를 간단히 굴립니다. 에탄올에서 트렁크를 제거하고 비어 있는 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
- 70% 에탄올로 살균된 수술용 가위를 사용하여 목에서 꼬리까지 몸통의 복부 쪽 피부를 절개합니다. 멸균 집게를 사용하여 마우스의 몸통에서 피부를 벗겨냅니다.
- 3x 항생제/항진균 용액 3mL가 들어 있는 6웰 접시에 진피 쪽이 아래로 향하게 하여 피부를 놓고 실온에서 2-3분 동안 배양합니다.
- 다음 설정이 있는 상태에서 조직 다지기를 켭니다. 슬라이스 두께: 1μm; 블레이드 힘: 최대치의 ~60%; 속도: 최대치의 ~50%.
- 진피 쪽이 아래로 향하게 하여 피부를 멸균 조직 초퍼 디스크에 옮기고 활성 조직 초퍼에 피부를 완전히 3회 통과시킵니다.
- 균질화된 피부를 3mL의 피부 소화 완충액이 들어 있는 멸균된 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다(10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액, 1% L-글루타민, 10mg/mL 콜라겐분해효소 I형, 0.25% 돼지 트립신 및 0.02mg/mL 데옥시리보뉴클레아제 I를 함유한 신선한 피부 소화 완충액 3mL를 RPMI 1640에 준비). P1000 마이크로피펫으로 위아래로 10-15회 피펫팅하여 생성된 현탁액을 혼합합니다.
- 원뿔형 튜브를 덮고 37°C 수조에서 15분 동안 샘플을 배양하고 3-5분마다 튜브를 뒤집습니다.
- 실온에서 5분 동안 750 x g의 스윙 버킷 로터에서 원뿔형 튜브를 원심분리하여 피부 균질화의 세포를 펠렛화합니다.
- P1000 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피부 소화 버퍼를 천천히 완전히 제거합니다.
메모: 이 단계에서 전체 피부의 일부를 저장하고 세포 순도를 확인하기 위한 대조군으로 사용할 수 있습니다. 70μm 세포 스트레이너를 통해 이러한 세포를 변형시키고 추가 프로세스를 수행합니다. - P1000 마이크로피펫으로 15-20회 위아래로 피펫팅하여 1mL의 멜라닌 세포 배지에 세포 펠렛을 완전히 재현탁합니다. 생성된 세포 용액을 1mL의 멜라닌 세포 배지가 들어 있는 6웰 접시의 코팅되지 않은 웰에 적가합니다.
- 도금된 피부 균질액을 37°C 및 5% CO2로 설정된 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다. 배양물을 40분 동안 배양합니다.
메모: 이 기간 동안 피부 균질산염의 일부 섬유아세포는 코팅되지 않은 접시에 부착되는 반면 멜라닌 세포와 각질 세포는 현탁 상태로 남아 있습니다. - 코팅되지 않은 접시의 배양 상층액을 미리 세척되고 콜라겐이 코팅된 6웰 접시의 한 웰로 옮깁니다. 최종 농도가 100ng/mL가 되도록 배지에 G418을 추가합니다.
- 섬유아세포 배지 2mL를 접착성 섬유아세포가 함유된 코팅되지 않은 접시의 한 웰에 추가합니다.
- 37°C 및 5% CO2로 설정된 조직 배양 인큐베이터에서 두 배양을 밤새 배양합니다.
- 도금 후 16-24시간 후에 각 배양물의 배지와 파편을 별도로 흡인합니다. 각 접시를 1mL의 멸균 PBS로 두 번 세척한 다음 2mL의 신선한 멜라닌 세포 배지와 100ng/mL G418을 멜라닌 세포 배양에 추가하고 2mL의 신선한 섬유아세포 배지를 섬유아세포 배양에 추가합니다. (영양 혼합물 F-12 햄 배지에 10% 소 태아 혈청, 7% 말 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액, 1% L-글루타민, 0.5mM 디-부티릴 고리형 AMP(dbcAMP), 20nM 테트라데카닐 환형 AMP(20nM 테트라데카닐 포르볼 13-아세테이트) 및 200pM 콜레라 독소(CT)를 포함하는 신선한 멜라닌 세포 배지 6mL를 준비합니다.
참고: 농축된 dbcAMP, TPA 및 CT 원액을 제조, 분주 및 -80°C에서 >1년 동안 저장할 수 있습니다. 이러한 성분이 없는 기본 배지는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
Dulbecco의 Modified Eagle 배지에서 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민을 포함하는 섬유아세포 배지 4mL를 준비합니다. 이 매체는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. - 멜라닌 세포 배양액을 G418로 48시간 동안 처리한 후 1mL의 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척하고 G418이 없는 새로운 멜라닌 세포 배지 2mL를 배양액에 추가합니다.
메모: G418 처리 후 멜라닌 세포 배양의 섬유아세포가 계속 사멸함에 따라 멸균 PBS로 접시를 세척하여 죽은 세포를 제거하고 새로운 멜라닌 세포 배지를 추가합니다. 멜라닌 세포와 섬유아세포 배양은 70-80% 포화도에 도달할 때 통과해야 합니다.
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 에탄올, 200 proof | 피셔 사이언티픽 | 22032601 | |
| 항생제 항진균 용액 (100x) | 시그마-알드리치 | A5955 | |
| McIlwain 조직 초퍼 | 테드 펠라 | 10180 | |
| 티슈 초퍼 블레이드 | 테드 펠라 | 121-6 | |
| 조직 초퍼 플라스틱 디스크 | 테드 펠라 | 10180-01 | |
| 콜라겐 분해 효소 유형 I | 워딩턴 생화학 물질 | LS004156 | |
| 돼지 트립신 | 시그마-알드리치 | 85450씨 | |
| 트립신 | 폭스바겐 | VWRL0154-0100 | |
| G418 디설파이드 | P212121 | LGB-418-1 | |
| 둘베코의 변형된 독수리 매체 | 지브코 | 제12800-082 | |
| RPMI 1640 미디어 | 시그마-알드리치 | R8758 | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | 시그마-알드리치 | D8537 | |
| 6웰 세포 배양 접시 | 시그마-알드리치 | SIAL0516 | |
| 5 mL 폴리스티렌 라운드 보텀 튜브 | 피셔 사이언티픽 | 352008 | |
| 10cm 세포 배양 접시 | 코 닝 | 430167 | |
| 소 세럼 알부민 | 피셔 사이언티픽 | BP9706-100 | |
| 소 태아 세럼 | 시그마-알드리치 | 12306씨 | |
| 코닝 페니실린/스트렙토마이신 용액 | 피셔 사이언티픽 | 제30-002-CL | |
| 영양소 믹스 F-12 햄 미디어 | 시그마-알드리치 | N6760 | |
| 쥐 꼬리에서 추출한 콜라겐 | 시그마-알드리치 | C7661 | |
| 0.2μm PES 멸균 주사기 필터 | 폭스바겐 | 제28145-501 | |
| 40μm 세포 스트레이너 | 피셔 사이언티픽 | 22363547 | |
| 70 μm 세포 스트레이너 | 피셔 사이언티픽 | 22363548 | |
| 콜레라 독소 | 시그마-알드리치 | C8052 | |
| 호스 세럼 | 피셔 사이언티픽 | 26050088 | |
| 하이클론 L-글루타민 | 피셔 사이언티픽 | SH3003402 |
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