재조합 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCPyV) 비리온 제제: 고역가 재조합 MCPyV 비리온을 생산하는 기술

초록

출처: Wei Liu et al. 메르켈 세포 폴리오마바이러스 감염 및 검출, J. Vis. Exp. (2019년)

이 비디오에서는 273TT 세포를 사용하여 메르켈 세포 폴리오마바이러스 또는 MCPyV 비리온을 제조하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 재조합 MCPyV 비리온의 고역가를 생성하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 재조합 MCPyV 비리온 준비

1. 50μg의 pR17b 플라스미드(운반 MCPyV 게놈)를 200μL 부피(37°C에서 4시간)에서 250U의 BamHI-HF와 함께 분해하여 벡터 골격에서 바이러스 게놈을 분리합니다(그림 1).
2. 분해된 DNA에 1200μL의 완충액 PB(10μL의 3M NaAc, pH 5.2 보충)를 추가하고 2개의 miniprep 스핀 컬럼(DNA 용량 20μg)을 정제합니다. 각 컬럼에서 분해된 pR17b 플라스미드를 200μL의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA)으로 용리합니다.
3. 50mL 원심분리 튜브에서 결찰 반응을 준비합니다. 1.2단계에서 정제된 플라스미드 DNA 400μL, 1.05x T4 리가제 완충액 8.6mL 및 고농도 T4 리가제 6μL를 추가합니다. 16 °C에서 밤새 배양합니다.
4. 45mL의 완충액 PB(3M NaAc, pH 5.2 10μL 보충)를 접합부에 추가하고 진공 매니폴드를 사용하여 2개의 miniprep 스핀 컬럼을 로드합니다. 각 컬럼을 50μL의 TE 완충액으로 용리시킵니다. 약 30μg의 DNA를 수율로 예상합니다.
5. 늦은 오후/저녁에 6 x 10

결과

그림 1. 재조합 바이러스 게놈을 사용한 MCPyV 비리온 생산.(A) pR17b(MCPyV 게놈 플라스미드)의 플라스미드 맵. (B) 그래디언트를 통해 수확 및 정제된 MCPyV 비리온 샘플의 대표적인 그림. 화살표는 그래디언트의 핵심에 집중된 MCPyV virion 띠를 표시합니다. (C) 각 구배 분획의 바이러스 게놈 복제 수는 qPCR을 사용하여 정량화되었습니다. Core Gradient fractions(그래디언트 상단부터 세는 숫자는 그래프 하단에 표시됨). 오차 막대는 3개의 기술 반복에 대한 평균(S.E.M.)의 표준 오차를 나타냅니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12 매체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제11330-032
재조합 인간 EGF 단백질, CF	R&D 시스템	236-EG-200	섭씨 -80도에서 보관하십시오
CHIR99021	케이맨 화학	13122	섭씨 -80도에서 보관하십시오
CHIR99021	시그마	SML1046	섭씨 -80도에서 보관하십시오
콜라겐분해효소 IV형	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17104019
디스플레이 II	로슈	4942078001
항생제-항진균제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제15240-062	빛으로부터 보호
DMEM 매체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11965084
파라포름알데히드	시그마	P6148
안티 MCPyV LT (CM2B4)	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-136172	로트 # B2717
MCV VP1 토끼		토끼 polyclonal 혈청 #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm

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