재조합 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCPyV) 비리온 제제: 고역가 재조합 MCPyV 비리온을 생산하는 기술

초록

출처: Wei Liu et al. 메르켈 세포 폴리오마바이러스 감염 및 검출, J. Vis. Exp. (2019년)

이 비디오에서는 273TT 세포를 사용하여 메르켈 세포 폴리오마바이러스 또는 MCPyV 비리온을 제조하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 재조합 MCPyV 비리온의 고역가를 생성하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 재조합 MCPyV 비리온 준비

1. 50μg의 pR17b 플라스미드(운반 MCPyV 게놈)를 200μL 부피(37°C에서 4시간)에서 250U의 BamHI-HF와 함께 분해하여 벡터 골격에서 바이러스 게놈을 분리합니다(그림 1).
2. 분해된 DNA에 1200μL의 완충액 PB(10μL의 3M NaAc, pH 5.2 보충)를 추가하고 2개의 miniprep 스핀 컬럼(DNA 용량 20μg)을 정제합니다. 각 컬럼에서 분해된 pR17b 플라스미드를 200μL의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA)으로 용리합니다.
3. 50mL 원심분리 튜브에서 결찰 반응을 준비합니다. 1.2단계에서 정제된 플라스미드 DNA 400μL, 1.05x T4 리가제 완충액 8.6mL 및 고농도 T4 리가제 6μL를 추가합니다. 16 °C에서 밤새 배양합니다.
4. 45mL의 완충액 PB(3M NaAc, pH 5.2 10μL 보충)를 접합부에 추가하고 진공 매니폴드를 사용하여 2개의 miniprep 스핀 컬럼을 로드합니다. 각 컬럼을 50μL의 TE 완충액으로 용리시킵니다. 약 30μg의 DNA를 수율로 예상합니다.
5. 늦은 오후/저녁에 6 x 10⁶ 293TT 세포를 10% 태아 송아지 혈청, 1% 비필수 아미노산 및 1% 하이그로마이신 B가 없는 L-글루타민이 보충된 DMEM 배지가 포함된 10cm 접시에 파종합니다.
6. 다음 날 아침에는 세포가 약 50% 정도 밀집되어 있는지 확인합니다. 66 μL의 transfection 시약(1.1 μL/cm²), 1.4단계에서 12 μg의 re-ligated MCPyV 분리 R17b DNA, 8.4 μg의 ST 발현 플라스미드 pMtB 및 9.6 μg의 LT 발현 플라스미드 pADL을 사용하여 transfection합니다.
7. 형질주입된 세포가 거의 합류하면 다음 날 세포를 트립신화하고 15cm 접시에 옮겨 지속적인 증식을 위해 세포를 옮깁니다.
8. 선택적으로 확장 시 소수의 293TT 세포를 취하고 MCPyV LT(CM2B4) 및 VP1(MCV VP1 토끼)에 대한 IF 염색을 수행하여 transfection 효율을 측정합니다. 이 단계에서 핵 LT 신호는 볼 수 있지만 VP1 발현은 감지되지 않을 수 있습니다.
9. 15cm 접시가 거의 합류하면(보통 초기 transfection 후 5-6일) 세포를 3개의 15cm 접시로 옮깁니다. 15cm 접시에서 세포가 거의 합류할 때 세포를 채취하고 아래의 바이러스 채취 프로토콜을 따릅니다.
   메모: 필요에 따라 1.8단계에 설명된 대로 품질 관리 IF를 수행합니다. 이 단계에서 대부분의 셀은 MCPyV LT와 VP1 모두 양성이어야 합니다.
10. 바이러스를 채취하려면 세포를 트립신화하고 RT에서 5분 동안 180 x g으로 회전한 다음 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿 부피 DPBS-Mg(9.5mM MgCl₂ 및 1x 항생제-항진균제가 포함된 DPBS)를 추가합니다. 그런 다음 25mM 황산암모늄(1M pH 9 원액에서 추출)을 첨가한 다음 0.5% Triton X-100(10% 원액에서 추출), 0.1% 벤조나제 및 0.1%의 ATP 의존성 DNase를 추가합니다. 잘 섞어 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
11. 혼합물을 얼음에서 15분 동안 배양한 다음 0.17부피의 5M NaCl을 추가합니다. 섞어서 얼음 위에서 15분 더 배양합니다. 4°C 원심분리기에서 12,000 x g에서 10분 동안 회전합니다. 상등액이 투명하지 않으면 튜브를 부드럽게 뒤집고 회전 단계를 반복합니다. 상등액을 새 튜브로 옮깁니다.
12. 0.8M NaCl이 보충된 1부피의 DPBS를 사용하여 펠릿을 재현탁하고 1.11단계에서 설명한 대로 다시 회전합니다.
13. 1.11 단계와 1.12 단계의 상등액을 결합하고 1.11 단계에서 설명한대로 한 번 더 회전합니다.
14. 긴 바늘 또는 p1000 피펫이 장착된 3mL 주사기를 사용하여 3mL 단계를 밑받침(27%, 33%, 39%) ~0.7mL 단계로 얇은 벽 5mL 폴리알로머 튜브에 요오딕산올 그라디언트를 붓습니다.
15. 준비된 요오딕산올 구배에 정제된 바이러스 함유 상등액 3mL를 로드합니다.
16. SW55ti 로터에서 234,000 x g 및 16 °C에서 3.5시간 동안 회전합니다. 가속 및 감속을 느리게로 설정합니다.
17. 초원심분리 후 실리콘화 튜브에 12개의 분획을 수집합니다(각 분획은 ~400μL).
18. dsDNA 시약 및/또는 VP1(MCV, VP1, 토끼)에 대한 웨스턴 블롯에 의한 바이러스 존재 여부에 대한 분획을 분석합니다. 피크 dsDNA 및/또는 VP1 함량으로 구배 분획을 풀링하고 정량적 PCR로 스톡을 특성화하여 바이러스 게놈 등가물을 계산합니다. MCPyV 비리온 재고는 -80 °C에서 보관하십시오.

결과

그림 1. 재조합 바이러스 게놈을 사용한 MCPyV 비리온 생산.(A) pR17b(MCPyV 게놈 플라스미드)의 플라스미드 맵. (B) 그래디언트를 통해 수확 및 정제된 MCPyV 비리온 샘플의 대표적인 그림. 화살표는 그래디언트의 핵심에 집중된 MCPyV virion 띠를 표시합니다. (C) 각 구배 분획의 바이러스 게놈 복제 수는 qPCR을 사용하여 정량화되었습니다. Core Gradient fractions(그래디언트 상단부터 세는 숫자는 그래프 하단에 표시됨). 오차 막대는 3개의 기술 반복에 대한 평균(S.E.M.)의 표준 오차를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12 매체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제11330-032
재조합 인간 EGF 단백질, CF	R&D 시스템	236-EG-200	섭씨 -80도에서 보관하십시오
CHIR99021	케이맨 화학	13122	섭씨 -80도에서 보관하십시오
CHIR99021	시그마	SML1046	섭씨 -80도에서 보관하십시오
콜라겐분해효소 IV형	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17104019
디스플레이 II	로슈	4942078001
항생제-항진균제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제15240-062	빛으로부터 보호
DMEM 매체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11965084
파라포름알데히드	시그마	P6148
안티 MCPyV LT (CM2B4)	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-136172	로트 # B2717
MCV VP1 토끼		토끼 polyclonal 혈청 #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm

) 호 . 년 . . ) ) 호 ) (영문)