CUBIC 기반 단백질 발현 시각화: 전체 두께 마우스 피부 생검에서 단백질 발현을 시각화하는 절차

Abstract

출처: Liang, H. et al. CUBIC 프로토콜은 전체 마운트 피부 제제에서 단일 세포 해상도로 단백질 발현을 시각화합니다. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 3D의 단일 세포 해상도에서 전체 마운트 피부 생검에서 단백질 발현의 시각적 평가를 위한 조직 투명화 의존적 이미징 기술인 CUBIC 기반 시각화 기술에 대해 설명합니다. 기술적으로 간단한 이 프로토콜을 사용하면 피부 절편을 준비하지 않고도 피부 단백질을 시각화할 수 있습니다.

Protocol

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 투명한 마우스 피부 조직의 준비

참고: 이 연구에 사용된 모든 마우스는 C57BL/6 유전적 배경에 있었습니다

.

1. 마우스 피부 조직 수집.
   1. 자궁경부 탈구로 생쥐를 인도적으로 안락사시킵니다.
   2. 피부에 상처가 나지 않도록 트리머로 해당 피부 부위의 털을 조심스럽게 제거합니다.
   3. 인산염 완충 식염수(PBS)에 70% 에탄올로 오염을 제거하려면 피부를 씻으십시오.
   4. 집게로 등쪽 목 피부를 들어 올리고 가위로 절개합니다.
   5. 등쪽 쥐 피부의 넓은 영역(약 1.5 x 4cm)을 절개합니다.
   6. 여과지에서 진피 쪽이 아래로 향하게 피부를 평평하게 하고 샘플의 전후 방향을 기록해 둡니다.
   7. 절개된 피부 주위의 여과지를 자르고 PBS에 갓 준비한 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 채운 15mL 튜브에 넣습니다.
   8. 실온에서 1시간 동안 고정하거나 4°C의 냉장고에서 하룻밤 동안 ....

Results

그림 1: 이미징 챔버 준비. A: 이미징 챔버 준비에 필요한 소모품은 파란색 압정, 플레이 도우 또는 이와 유사한 것, 커버슬립(24 x 50mm) 2개입니다. B: 파란색 압정(직경 약 2mm x 2cm)의 얇은 스트립 2개와 커버슬립 2개를 준비합니다. C: 하나의 커버슬립에 파란색 압정 스트립을 놓고 피부 생검을 위한 충분한 공간을 확보합니다. 두 스트립 사이에 있는 CUBIC2 용액 한 방울에 피부 생검을 놓습니다. D: 두 번째 커버슬립을 파란색 압정 스트립에 올려 피부 생검을 덮습니다.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6418
에탄올 96 % (변성되지 않은)	화학 공급	유엔1170
4', 6-디아미디노-2-페닐린돌 (국방부)	로슈	10236276001
N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민	머크 밀리포어	821940
폴리에틸렌 글리콜 모노-p-이소옥틸페닐 에테르	머크 밀리포어	648462
트리톤 X-100	머크 밀리포어	648462
자당	시그마-알드리치	S0389
최적 절단 온도 (10월) 화합물	티슈텍	4583
anti-Keratin14 항체	코밴스	PRB-155P
anti-Ki67 항체	아브캠	AB16667
당나귀 안티 토끼 Alexa 594	생명 기술	A21207
디메틸설폭사이드	시그마-알드리치	D2650
요소	머크 밀리포어	66612
2,2",2"-니트릴로트리에탄올	머크 밀리포어	137002
컨포칼 현미경	니콘 인스트루먼트 Inc	Nikon A1 - 컨포칼 현미경
cruZer6 페이스 트리머	브라운	브라운 크루저6 페이스
아지드화나트륨	시그마-알드리치	438456