CUBIC 기반 단백질 발현 시각화: 전체 두께 마우스 피부 생검에서 단백질 발현을 시각화하는 절차

초록

출처: Liang, H. et al. CUBIC 프로토콜은 전체 마운트 피부 제제에서 단일 세포 해상도로 단백질 발현을 시각화합니다. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 3D의 단일 세포 해상도에서 전체 마운트 피부 생검에서 단백질 발현의 시각적 평가를 위한 조직 투명화 의존적 이미징 기술인 CUBIC 기반 시각화 기술에 대해 설명합니다. 기술적으로 간단한 이 프로토콜을 사용하면 피부 절편을 준비하지 않고도 피부 단백질을 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 투명한 마우스 피부 조직의 준비

참고: 이 연구에 사용된 모든 마우스는 C57BL/6 유전적 배경에 있었습니다

.

1. 마우스 피부 조직 수집.
   1. 자궁경부 탈구로 생쥐를 인도적으로 안락사시킵니다.
   2. 피부에 상처가 나지 않도록 트리머로 해당 피부 부위의 털을 조심스럽게 제거합니다.
   3. 인산염 완충 식염수(PBS)에 70% 에탄올로 오염을 제거하려면 피부를 씻으십시오.
   4. 집게로 등쪽 목 피부를 들어 올리고 가위로 절개합니다.
   5. 등쪽 쥐 피부의 넓은 영역(약 1.5 x 4cm)을 절개합니다.
   6. 여과지에서 진피 쪽이 아래로 향하게 피부를 평평하게 하고 샘플의 전후 방향을 기록해 둡니다.
   7. 절개된 피부 주위의 여과지를 자르고 PBS에 갓 준비한 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 채운 15mL 튜브에 넣습니다.
   8. 실온에서 1시간 동안 고정하거나 4°C의 냉장고에서 하룻밤 동안 고정합니다.
   9. 15mL 튜브에 PBS로 2x 5분 동안 피부를 씻습니다.
      메모: 다음(1.1.10 - 1.1.12)은 조직의 장기 보관을 위한 선택적 단계입니다.
   10. 실온에서 1시간 세척 단계 동안 15mL 튜브의 에탄올 농도(25%, 50%, 70%)를 증가시켜 PBS에서 절개된 피부를 탈수합니다.
   11. 탈수된 피부는 PBS의 70% 에탄올에 15mL 튜브에 넣어 4°C에서 계속 사용할 때까지 보관하십시오.
   12. 세척 4시간 전, 실온에서 1시간 세척 단계 동안 15mL 튜브의 에탄올 농도가 감소(70%, 50%, 25%, 0%)인 PBS의 피부 조직을 재수화합니다.
2. 마우스 피부 생검 지우기
   1. 60-70°C로 설정된 히터에서 5.38mL 증류수에 3.85g 요소와 3.85g N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine을 용해하여 CUBIC1 세척 용액을 준비합니다.뜨거운 교반기를 사용합니다.
   2. 용액이 투명해지고 실온으로 냉각되면 2.31g 폴리에틸렌 글리콜 모노-p-이소옥틸페닐 에테르/트리톤 X-100을 용액에 추가합니다.
   3. 날카로운 면도날로 마우스 피부를 약 0.2 x 0.5cm 크기의 생검으로 자르고 15mL 튜브에 5mL의 CUBIC1 세척액을 담급니다. 모낭의 시각화를 최적화하려면 생검의 긴 쪽이 샘플의 전후 방향을 따라 절단되어야 합니다.
   4. 37 °C의 혼성화 오븐에서 회전 플랫폼에 놓습니다.
   5. 7일 후에 세척 용액을 교체하십시오. 사용하기 전에 새로운 CUBIC1 용액을 준비하십시오.
   6. 7일 후에 조직의 투명도를 확인하십시오. 필요한 경우 조직이 완전히 투명해질 때까지 CUBIC1 세정 용액에 생검을 둡니다.
   7. 피부 생검이 투명해지면 CUBIC1 용액을 제거하고 1x PBS 4mL를 첨가하여 37°C에서 6시간 동안 4회 세척합니다.
   8. 37 ° C에서 4 시간 동안 15 ml 튜브에 PBS의 20 % w / v 자당으로 피부 조직을 세척합니다.
   9. -80°C 냉동고에서 15mL 튜브에 담아 장착 매체 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 조직을 하룻밤 동안 동결합니다.
      메모: 이 단계는 후속 단계에서 항체 침투에 대한 생검의 투과성을 증가시킵니다.

2. 면역형광 염색

1. 조직을 (1.2.9 단계)에서 실온으로 2-3 시간 동안 해동합니다.
2. 15mL 튜브에 5mL의 PBS를 넣은 조직을 실온에서 8시간 동안 세척하여 OCT 화합물을 제거합니다.
3. 생검을 2mL 튜브에 옮기고 PBST(PBS + 0.1% Triton-X100)에 1:100으로 희석한 1mL 토끼 항 케라틴14 또는 토끼 항 Ki67 항체에서 조직을 37°C 오븐의 셰이커에서 3일 동안 배양합니다.
4. 생검을 15mL 튜브로 옮기고 37°C 오븐의 셰이커에서 5mL의 PBST로 조직을 6시간 동안 4회 세척합니다.
5. 생검을 2mL 튜브로 옮기고 PBST에서 1:100으로 희석된 1mL 항토끼 Alexa594 2차 항체를 첨가한 다음 37°C 오븐의 셰이커에서 3일 동안 배양합니다.
6. 생검을 15mL 튜브로 옮기고 37°C 오븐의 셰이커에서 5mL PBST로 조직을 6시간 동안 4회 세척합니다.
7. 생검을 2mL 튜브로 옮기고 PBST에 1mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 카운터 스테인 용액 (1:1,000)을 첨가한 다음 37 °C 오븐의 셰이커에서 밤새 배양합니다.
8. DAPI 대조 염색 용액을 제거하고 2mL 튜브에 PBST 1mL를 추가하여 37°C 오븐에서 셰이커에서 6시간 동안 조직을 4회 세척합니다.
   메모: 선택적 단계: 생검은 0.02% 아지드화나트륨이 포함된 1x PBS의 어두운 곳에서 최소 3주 동안 보관할 수 있습니다.

3. 이미징

1. 50%(w/v) 자당, 25%(w/v) 요소, 10%(w/v) 2,2',2'-니트릴로트리에탄올 및 0.1%(v/v) Triton X-100을 포함하는 CUBIC2 세정 용액을 준비합니다.
2. 2mL 튜브의 1mL CUBIC2 용액에 담긴 피부 조직을 37°C 오븐에서 24시간 동안 쉐이커에 담아 배양합니다. 이 단계는 조직의 굴절률을 균일하게 합니다.
3. 조직의 투명도를 확인하십시오. 투명해지면 전체 피부 생검(0.2 x 0.5cm)을 긴 쪽에 있는 유리 커버슬립에 올려 놓고 모낭 길이의 방향이 커버슬립 표면(#1 24 x 60mm)과 평행이 되도록 합니다.
   메모: 선택 단계: 항체 염색 생검은 CUBIC2 용액에 약 7일 동안 보관할 수 있습니다. 나일 레드 염색 생검은 CUBIC2 용액에 최대 1일 동안만 보관할 수 있으며 가능한 한 빨리 이미지를 촬영해야 합니다.
4. 이미징 챔버 준비(그림 1).
   참고: 이미징 챔버 준비에 필요한 소모품은 파란색 압정, 플레이 도우 또는 이와 유사한 것, 커버슬립(24 x 50mm) 2개입니다(그림 1A).
   1. 파란색 압정(직경 약 1mm x 2cm)의 얇은 스트립 2개와 커버슬립 2개를 준비합니다(그림 1B).
   2. 하나의 커버 슬립에 파란색 압정 스트립을 놓고 피부 생검을 위한 충분한 공간을 확보합니다(그림 1C, 3.4.3단계).
   3. CUBIC2 용액 한 방울의 커버슬립에 있는 스트립 사이에 피부 생검을 놓습니다(그림 1C).
   4. 두 번째 커버슬립으로 피부 생검을 덮습니다(그림 1D).
5. 장착된 피부 생검이 있는 이미징 챔버를 컨포칼 현미경의 스테이지에 놓고 조직을 광 경로로 이동합니다.
6. 수은 또는 할로겐 광원과 표준 에피 형광 필터(예: DAPI/GFP/CY3/CY5)를 사용하여 샘플을 스캔하여 관심 형광 염색 영역을 식별합니다.
7. 10X 및 20X 대물렌즈(NA 0.75) 및 표준 컨포칼 형광 이미징 기술을 사용하여 관심 영역을 이미지화합니다(예: DAPI 염색 샘플은 405nm 레이저로 조명하고 425-475nm 사이의 형광 신호를 수집하며, Alexa Fluor 594 또는 Nile Red 염색 샘플은 561nm 레이저로 조명하고 570-620nm 사이의 형광 신호를 수집합니다).
8. 현미경 Z-stack 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 각 관심 영역의 이미지 Z-스택을 생성합니다(예: 아래 설명된 NIS 요소 이미징 소프트웨어 4.13 사용).
   1. 최적의 레이저 출력을 보장하고 PMT HV/오프셋 설정을 선택하여 샘플 형광을 수집합니다.
   2. "Acquisition Controls"에서 "ND Acquisition" 도구 모음을 엽니다.
   3. "Z 시리즈 설정" 탭을 선택합니다(다른 모든 탭이 선택 취소되어 있는지 확인).
   4. 라이브 스캔하는 동안 샘플의 상단으로 초점을 맞추고 "상단" 버튼을 누릅니다.
   5. 샘플의 바닥에 초점을 맞추고 "하단" 버튼을 누릅니다.
   6. 필요한 스텝 크기를 입력합니다(또는 최적화된 스텝 크기 버튼을 누름).
   7. "지금 실행" 버튼을 누릅니다.
   8. 결과 Z 스택을 개별 Tiff 이미지 스택으로 저장합니다(이미지 Z 스택당 형광 색소 1개).
9. 이미지 Z 스택을 사용하여 3D 분석 소프트웨어(예: 아래 설명된 대로 Imaris x64 7.2.3 사용)를 사용하여 3D 볼륨 관심 영역을 재구성할 수 있습니다.
   1. 해석 소프트웨어를 시작합니다.
   2. 3D 볼륨 생성을 위해 도구 모음에서 "Surpass" 버튼을 선택합니다.
   3. 첫 번째 컬러 이미지 Z 스택(예: DAPI)을 엽니다.
   4. '채널 추가' 도구를 사용하여 형광 색소당 하나의 채널을 추가하여 색상 채널을 추가합니다. 따라서 DAPI와 Alexa Fluor 594 형광 색소를 모두 포함하는 샘플에는 두 개의 채널이 필요합니다.
   5. "이미지 속성" 도구를 사용하여 위의 3.7에서 결정된 대로 올바른 픽셀(복셀) 치수(XYZ)를 설정합니다.
   6. "디스플레이 조정" 도구를 사용하여 필요에 따라 채널 색상을 변경합니다(예: DAPI 채널을 파란색으로, Alexa Fluor 594 채널을 빨간색으로 설정).
   7. 이미지 창에 3D 볼륨을 배치하려면 필요에 따라 컴퓨터 마우스를 사용하여 볼륨을 클릭하고 드래그합니다.
   8. 도구 모음의 "스냅샷" 도구를 사용하여 3D 이미지의 스크린샷을 생성합니다.
   9. 도구 모음의 "애니메이션" 도구를 사용하여 3D 샘플 회전의 동영상을 생성합니다.

결과

그림 1: 이미징 챔버 준비. A: 이미징 챔버 준비에 필요한 소모품은 파란색 압정, 플레이 도우 또는 이와 유사한 것, 커버슬립(24 x 50mm) 2개입니다. B: 파란색 압정(직경 약 2mm x 2cm)의 얇은 스트립 2개와 커버슬립 2개를 준비합니다. C: 하나의 커버슬립에 파란색 압정 스트립을 놓고 피부 생검을 위한 충분한 공간을 확보합니다. 두 스트립 사이에 있는 CUBIC2 용액 한 방울에 피부 생검을 놓습니다. D: 두 번째 커버슬립을 파란색 압정 스트립에 올려 피부 생검을 덮습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6418
에탄올 96 % (변성되지 않은)	화학 공급	유엔1170
4', 6-디아미디노-2-페닐린돌 (국방부)	로슈	10236276001
N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민	머크 밀리포어	821940
폴리에틸렌 글리콜 모노-p-이소옥틸페닐 에테르	머크 밀리포어	648462
트리톤 X-100	머크 밀리포어	648462
자당	시그마-알드리치	S0389
최적 절단 온도 (10월) 화합물	티슈텍	4583
anti-Keratin14 항체	코밴스	PRB-155P
anti-Ki67 항체	아브캠	AB16667
당나귀 안티 토끼 Alexa 594	생명 기술	A21207
디메틸설폭사이드	시그마-알드리치	D2650
요소	머크 밀리포어	66612
2,2",2"-니트릴로트리에탄올	머크 밀리포어	137002
컨포칼 현미경	니콘 인스트루먼트 Inc	Nikon A1 - 컨포칼 현미경
cruZer6 페이스 트리머	브라운	브라운 크루저6 페이스
아지드화나트륨	시그마-알드리치	438456

년