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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 유전자 변형 일차 인간 각질 세포
참고: 완전한 DMEM 배지[DMEM + 10% 소 태아 혈청(FBS) + 펜/연쇄상구균]에서 성장한 양쪽 친화성 피닉스 세포를 사용하여 1차 인간 각질세포를 감염시키는 바이러스를 생성합니다. gag-pol 및 envelope와 같은 단백질을 암호화하는 바이러스 패키징 유전자는 피닉스 세포 게놈에 안정적으로 통합되어 레트로바이러스 벡터로 transfection될 때 바이러스 생성이 가능합니다. Phoenix 세포는 높은 효율로 transfection될 수 있어 높은 바이러스 역가 생산이 가능합니다. 이 포장 라인에서 생산된 바이러스는 인간을 포함한 다양한 포유류 세포를 감염시킬 수도 있습니다.
- Day 1: transfection 전날, 완전한 DMEM 배지에서 well당 800,000개의 세포 밀도로 6-well plate에 phoenix 세포를 seed합니다.
- 2일차: transfection이 있는 날에는 웰당 3μg의 레트로바이러스 벡터를 사용합니다. 3μg의 레트로바이러스 벡터를 1.5mL 튜브에 분취합니다. 3μg의 벡터마다 100μL DMEM과 6μL의 트랜스펙션 시약을 혼합하여 사용합니다. 1.5mL 튜브에서 6μL의 transfection 시약과 100μL DMEM을 혼합합니다. (사용되는 레트로바이러스 벡터는 장비/재료 표에 나열되어 있습니다.)
- 5분 동안 배양하고 106μg의 레트로바이러스 벡터가 들어 있는 사전 분취된 튜브에 3μL 혼합물을 추가합니다. RT에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다. 이 전체 혼합물을 피닉스 세포의 각 웰에 적가적으로 첨가합니다.
- 3일차: transfection 다음 날, phoenix 세포에서 배지를 제거하고 2mL의 새로운 완전 DMEM 배지를 추가합니다. 같은 날, 1차 인간 각질세포를 웰당 75,000개 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩합니다. 항생제(pen/strep)와 함께 각질세포 무혈청 배지(KCSFM)에서 각질세포를 유지합니다.
메모: 1차 인간 각질세포를 구입했습니다. 셀은 다양한 공급업체에서 구입할 수 있습니다(재료 표에 나열됨).
- 4일차: 현재 바이러스 입자를 포함하고 있는 형질주입된 피닉스 세포에서 배지를 수확합니다. 주사기를 사용하여 배지를 0.45μm 필터에 통과시키고(오염된 피닉스 세포 제거) 각질 세포(전날 75,000 세포/웰로 도금)에 2mL를 놓습니다. 헥사디메트린 브로마이드(5μg/mL)를 배지에 첨가하여 감염 과정을 중재하는 데 도움을 줍니다. 바이러스 역가는 ~1 x 107 TU/mL입니다.
- 원심분리기에서 200 x g의 6웰 플레이트를 RT에서 1시간 동안 회전시킵니다. 스핀 후 바이러스가 포함된 배지를 제거하고 KCSFM을 추가하기 전에 1x PBS로 세포를 한 번 세척합니다.
- 5일차: 헥사디메트린 브로마이드(5μg/mL)가 포함된 여과된 배지 2mL를 사용하여 1.4에서와 동일한 배치의 각질세포를 다시 감염시킵니다. RT에서 1시간 동안 200 x g로 회전시켜 바이러스가 포함된 매체를 제거하고 1x PBS로 세척한 다음 KCSFM.
를 추가합니다.
메모: 레트로바이러스 벡터에 선택 가능한 marker가 있는 경우 약물을 사용하여 각질세포를 선택하고 downstream 분석 또는 유기형 배양과 같은 응용 분야에 사용하기 위해 확장합니다.