각질세포 집락 형성 분석법: 각질세포가 집락으로 성장하는 능력을 평가하기 위한 체외 분석

초록

출처: Morris, R. J. et al. 마우스 표피 각질 세포와 그들의 체외 클론 생성 배양의 분리. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 성체 마우스에서 채취한 각질세포의 클론생성 분석을 수행하여 개별 세포가 증식하고 군체를 형성하는 능력을 확인합니다. 이 각질세포 채취 기법은 피부 화학적 발암 및 종양 촉진의 다른 하위 측면을 연구하는 데 유용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 1차 각질 세포 채취 및 파종

1. 승인된 동물 시설/IACUC 표준에 따라 CO₂ 흡입을 통해 4-5마리의 성체 암컷 마우스를 안락사시킵니다. 그러나, 이 프로토콜은 단일 암컷/수컷 마우스에도 사용될 수 있다.
   1. 전기 동물 가위로 등쪽 털의 약 9cm2를 자르고 잘린 모든 마우스를 500-1분 동안 덮을 수 있는 충분한 포비돈 요오드 소독액(스크럽 아님)이 있는 1mL 병에 넣습니다. 항아리를 잘 흔들어 생쥐 위에 소독액을 고르게 코팅합니다.
   2. 용액을 붓고 액체가 맑아질 때까지 깨끗한 물로 헹굽니다. 동일한 소독 세척을 반복한 다음 물로 헹굽니다. 요오드 용액으로 소독 세척 한 후 모든 마우스를 70 % 에탄올에 5-10 분 동안 담
      참고: 밝은 털(예: BALB/c)을 가진 마우스는 살균 요오드 세척제로 인해 약간의 황색을 유지하지만 더 어두운 마우스(예: C57BL/6)는 그렇지 않습니다. 특히, 세포 생존력이나 배양 성장은 노란색으로 인해 영향을 받지 않습니다.
2. 층류 후드에서 엄지 집게와 가위를 사용하여 잘린 등 피부를 조심스럽게 제거합니다. 절제된 등쪽 피부를 PBS/2x 겐타마이신으로 채워진 원뿔형 튜브에 넣습니다. 배양 시 유선세포 오염을 방지하기 위해 복부 쪽 피부를 사용하지 마십시오.
3. 오토클레이브 집게와 메스를 사용하여 털이 많은 쪽이 아래로 향하게 하여 얇은 페트리 접시에 한 번에 하나씩 등쪽 피부를 놓습니다. 피부 조직의 복부 쪽에서 지방을 포함한 모든 피하 조직이 반투명해질 때까지 긁어내기 시작합니다. 피부(모낭 부분)를 찢지 않고 피하 조직의 흔적을 최대한 제거하십시오. 또한 장시간 긁지 말고 피부 건조를 피하십시오.
   1. 긁어낸 피부는 다른 모든 피부가 처리될 때까지 PBS 용액에 보관하십시오. 그런 다음 메스를 사용하여 껍질을 0.5cm x 1-1.5cm 스트립으로 자르고 털이 많은 면을 위로 향하게 하여 멸균 페트리 접시에 놓습니다.
4. 트립신(0.25%)과 혼합된 PBS/2x 겐타마이신 용액 20mL를 100mm x 20mm 플라스틱 페트리 접시에 조심스럽게 피펫팅합니다. 멸균 겸자를 사용하여 피부를 옮기고 32°C 인큐베이터에서 2시간 동안 트립신 용액 표면에 털이 많은 면이 위로 향하게 띄웁니다.
   참고: 트립신화 시간과 온도는 배양 가능성이 높은 1차 각질세포의 양호한 수율을 위해 매우 중요합니다. 다른 방법으로도 생존 가능한 세포의 좋은 수율을 제공할 수 있지만, 각질 세포의 배양 가능성은 그다지 만족스럽지 못했습니다.
   1. 이 2시간의 배양 시간 동안 접시에 콜라겐 코팅을 하고 37°C에서 1시간 동안 놓습니다(1.1.2단계 참조). 클론 생성 분석의 경우, 60mm 페트리 접시는 각질 세포 수확 24시간 전에 코팅되어 조사된 3T3 공급층이 바닥에 부착되어 고르게 펴 바를 수 있도록 합니다.
      메모: 클론 생성 배양을 위한 배양 접시의 코팅은 마우스 표피 각질 세포의 적절한 부착, 집락 형성 및 궁극적인 성장/증식에 매우 중요합니다.
5. 표피 긁는 단계: 멸균 플라스틱 사각형 페트리 접시를 배열하고 30mL의 수확 매체로 적절한 표피 긁기를 위해 15° 경사의 표면을 만듭니다(표 1 참조). 구부러진 집게로 트립신 용액에서 떠 있는 피부 스트립을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 새 메스 날로 표피와 털을 배지로 긁어냅니다.
   1. 과도한 힘을 가하지 말고 표피를 긁거나 세포 생존력에 영향을 줄 수 있을 만큼 충분한 힘을 가하십시오.
   2. 표피를 긁는 동안 칼날을 피부 조각에 수직으로 유지하십시오. 칼날이 칼날의 움직임 쪽으로 기울어져 있으면 피부가 찢어질 가능성이 더 높아집니다. 칼날이 칼날의 움직임에서 멀어지게 기울어져 있으면 표피가 불완전하게 제거될 가능성이 더 높아집니다.
6. 긁어낸 표피 세포가 들어 있는 수확 배지를 1.5인치 마그네틱 교반 막대가 있는 멸균 60mL 용기(오토클레이브 및 재사용 가능)에 조심스럽게 붓습니다. 추가 채취 배지로 페트리 접시를 헹구어 남아 있는 표피 세포를 수집하고 최종 부피를 30mL로 만듭니다. 자석 교반기를 사용하여 실온에서 100분 동안 20rpm으로 저어줍니다. 이 과정은 모발에서 갇힌 표피 세포를 제거합니다.
7. 멸균 70μm 세포 여과기를 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓습니다. 세포 여과기는 50mL 원뿔형 튜브 위에 맞습니다.
   1. 항아리를 생물 안전 후드 안으로 가져 가십시오. 교반 막대를 제거하고 내용물을 50mL 원뿔형 튜브에 부착된 여과기 필터에 붓습니다. 원치 않는 머리카락과 각질층을 걸러냅니다.
   2. 여과기 내의 각질층 물질과 함께 모발을 누르고 조작하여 갇힌 유모 세포를 풀어줍니다. 5mL의 수확 배지를 사용하여 갇혀 있는 나머지 세포가 분리되어 튜브 안으로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다. 원뿔형 튜브에서 총 부피를 최대 50mL까지 가져옵니다.
8. 50mL 원뿔형 튜브를 셀 여과액과 원심분리기로 160 x g에서 4°C에서 7분 동안 마개합니다. 다음으로, 상등액을 흡인하고 5mL의 수확 배지를 첨가합니다. 마지막으로, 5mL 피펫으로 부드럽게 ~20x 분쇄하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   1. 이 단계에서는 집계를 방지하기 위해 셀을 아이스박스에 보관합니다. 다음으로, 25mL의 수확 배지를 추가하고 다시 분쇄합니다(20-25x).
   2. 이 단계에서 정확한 각질세포 수를 보장하려면 1mL의 세포 현탁액을 취하고 19mL의 수확 배지를 추가합니다. 이제 세포 희석은 50mL 원뿔형 튜브에서 1:20입니다. 단일 마우스에서 각질세포를 채취하는 경우 세포 현탁액의 부피를 조정합니다. 예를 들어, 30mL 대신 15mL를 사용하고 세포 계수를 위해 1:10 희석을 만듭니다.
9. 50mL 코니컬 튜브(1:20 희석)에서 희석된 세포 0.5mL를 파이펫으로 주입하고 1.5mL 오토클레이브 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다른 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 0.2mL(200μL)의 세포 혼합물을 제거하고 동일한 부피(200μL)의 0.4% 트리판 블루 용액을 추가합니다. 이 용액을 3배 부드럽게 혼합하고 세포를 혈구계로 옮겨 유핵 각질 세포를 계수합니다.
   1. 트리판 블루에 양성인 모든 짙은 파란색 세포는 생존 불가능한 죽은 세포로 점수를 매기고, 작은 금색 및 분홍빛을 띤 세포는 생존 가능한 세포로 점수를 매깁니다. 따라서 마우스 한 마리당 최종 각질 세포 수율은 약 3,000만 개의 생존 가능한 세포가 되어야 합니다.
10. 원래 50mL 코니컬 튜브(단계 1.8부터)를 4°C에서 160 x g으로 7분 동안 원심분리합니다. 이 단계에서 원하는 배지에 세포를 재현탁하고 세포 파종에 필요한 희석을 만듭니다.
    1. 대량 배양의 경우, 세포 배양 배지(KGM형 배지 + 단층 배양용 보충제)의 각 35mm 페트리 접시에 2-400만 개의 생존 가능한 금 세포를 파종합니다(표 1 참조). 클론 생성(콜로니 형성) 분석을 위해 60mm 페트리 접시당 1,000개의 세포를 X선으로 조사하여 스위스 마우스 3T3 피더층에 콜라겐 코팅을 조사하고 변형된 Willia's E 배지에 보충제와 혈청을
    주입합니다.
    2. 35mm 및 60mm 페트리 접시에 각각 2-4mL 배지를 사용합니다. 또한 5% CO₂에서 사용하기 위해 중탄산나트륨 수준이 감소된 ATCC에서 조달한 DMEM 및 Williams E 배지를 공식
    화합니다.
11. 배양 세포(질량 또는 클론 생성)를 32°C, 95% 습도, 5% CO₂로 성장시킵니다. 대량 배양을 위한 초기 파종 후 하루 후에 배지를 변경하고 그 후에는 매주 3회 변경합니다. 그러나 클론 분석의 경우 첫 번째 배지 변화는 세포 파종 후 2일 후이고 그 이후에는 매주 3회입니다.
12. 클론 배양의 경우, 2주 및 4주 간격으로 세포를 배양합니다. 클론 배양 완료(2주 또는 4주) 후 배지를 흡인합니다. 콜로니를 10% 완충 포르말린에 실온에서 하룻밤 동안 고정하고 0.5% 로다민 B로 오토클레이브 물에 1시간 동안 염색합니다. 그런 다음 접시 가장자리에서 피펫으로 로다 민 B 얼룩을 제거하십시오.
    1. 접시가 깨끗해질 때까지 차가운 오토클레이브 물로 접시를 헹굽니다. 접시 뚜껑에 기울어진 접시를 놓고 최종 식민지 계수를 위해 말리십시오. 특히 클론 생성 배양 분석을 수행할 때 <1mL의 세포를 피펫팅하지 마십시오. 세포가 농축되어 있으면 세포 농도를 연속적으로 희석하십시오.

솔루션 및 미디어	코멘트
수확 솔루션
2.5% 트립신(5mL)
둘베코의 PBS (500mL)
겐타마이신(2mL)
2x 겐타마이신이 함유된 PBS(45mL)
2x 겐타마이신을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)
트립신 용액
세포 배양 솔루션
Purecol-fibronectin 식기 코팅 솔루션:
1m 헤페스(1mL)
116mM CaCl2(1mL)
소 혈청 알부민 1.0 mg/mL (10 mL)
세포 배양 배지(100mL)
피브로넥틴(1mg)
퓨어콜 콜라겐 (1 mL)
세포 동결 용액
DMSO(2mL)
10% BCS 및 펜 스트렙을 함유한 DMEM
수확 매체	칼슘이 없어야 합니다.
2x 겐타마이신(1mL)
FBS(50mL)
SMEM (500 mL)
High-Calcium Williams의 E 미디어:
EGF (5 μg/mL) 1 mL
글루타민 14.5 mL
하이드로코르티손(1mg/mL) 0.5mL
인슐린 1 mL
리노산-BSA (0.1 mg/mL) 0.5 mL
MEM Ess 아미노산 4 mL
MEM 비타민 5 mL
페니실린-스트렙토마이신 5 mL
트랜스페린(5mg/mL) 1mL
비타민 A(1mg/1,000μL) 57.5μL
비타민 E 1 mg/mL (4°C) 3.5 μL
비타민 D2 (10 mg/mL) 50 μL
3T3 섬유아세포 완전 성장 배지(CGM)
BCS(100mL)
DMEM(900mL)
페니실린-스트렙토마이신(10mL)
KG엠	대량 배양에 사용되는 배지는 환원된 칼슘 배지입니다.
Williams의 E와 동일한 보충제를 함유한 Morris 2 배지	보충제를 통한 Williams E의 감소된 칼슘 변형

표 1: 솔루션 및 미디어 레시피.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.4% 트리판 블루 1x 0.9% 식염수	생명 기술 Gibco	제15250-061
1.5 인치 마그네틱 교반 바 (피벗 링 포함	벨 아트, 웨인	371101128	2oz Nalgene 항아리에 들어
10 mL 일회용 피펫	BD 팔콘	357551
150cm2(T-150) 배양 플라스크	코 닝	430825
2 oz Nalgene 항아리	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제2118-0002	60 밀리리터
2.5% 트립신 용액 10x	생명 기술 Gibco	제15090-046
50 mL 멸균 코니클 튜브	BD 팔콘	352098
셀 스트레이너, 70μm 멸균	BD 디스커버리 랩웨어	352350
콜라겐, 소, I형, 30mg	BD 바이오사이언스	354231
증류수 Milli-Q			신선하게 만든; 두 번 증류 된 역삼 투 물
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x, Ca2+ 및 Mg2+ 무함유	생명 기술 Gibco	14190-144	메 마른
둘베코의 변형 독수리 배지(DMEM)	증권 시세	2002년 30월 30
소 태아 혈청(FBS)	Thermo Fisher Scientific 하이클론		재질 보기 SH 300070.03
겐타마이신 50 mg/10 mL	생명 기술 Gibco	제15750-060
No. 22 멸균 스테인리스 스틸 블레이드	BD 바드 파커	371222
No. 4 메스 손잡이	생물 의학 연구 기기	26-1200	70% 에탄올이 함유된 컵에
가위 한 쌍	생물 의학 연구 기기	25-1050	70% 에탄올이 함유된 컵에
엄지 드레싱 겸자 한 쌍	밀리텍스	4월 6일	70% 에탄올이 함유된 컵에
광장 멸균 플라스틱 페트리 접시	BD 팔콘	351112
스위스 마우스 3T3 섬유아세포	증권 시세	CCL-92	10 구절 이내에서 사용
윌리엄스 E 미디엄	생명 기술 Gibco	제12551-032
SMEM: 현탁액 배양을 위한 Ca2+ 및 Mg2+ 무료 최소 필수 배지	생명 기술 Gibco	11380-037

호 ) 있습니다. ) 호 호 년 표시기 일 호 년 년 표시기 호 년