miniCoopR 벡터 기반 형질전환: 제브라피시 종양 모델에서 흑색종 유발 유전자를 스크리닝하는 기술

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 흑색종 발병 조절제 스크리닝

1. PCR에 의해 Gateway 중간 진입 클론을 생성하고, 관심 유전자(GOI)의 전체 길이 개방 판독 프레임을 증폭하고 BP clonase II(Invitrogen)를 사용하여 pDONR 221로 재조합합니다. Multisite Gateway 기술(Invitrogen)을 사용하여 p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA 및 miniCoopR을 재조합하여 miniCoopR 벡터의 mitfa promoter 아래에 관심 유전자를 배치합니다(그림 1A)
.
2. 25 피코그램의 Tol2 transposase mRNA와 함께 각 클론의 25 피코그램을 1 세포 Tg(mitfa:BRAFV600E)에 주입합니다. P53(LF); MITFA (LF) 앞서 설명한 바와 같이 삼중 동형 접합 제브라 피쉬 배아. 주입된 배아를 28.5°C에서 배양합니다.24hpf에서 죽은 배아를 제거합니다.
3. 주입된 배아가 들어 있는 페트리 접시를 흰색 배경의 입사광 아래에서 해부 현미경에 올려 72hpf에서 구조된 멜라닌 세포를 가진 형질전환 동물을 선택합니다(그림 1A).
4. 4 dpf의 제브라피시 시설의 보육원에 있는 3L 탱크로 동물을 이송합니다.
5. 2개월이 되면 멜라닌 세포 구조 영역이 4mm² 이상인 동물을 선택합니다(그림 1A). 72 hpf의 멜라닌 세포 구조 정도와 2개월 시점의 멜라닌 세포 구조 정도 사이에는 강한 상관관계가 있습니다. 멜라닌 세포 구조가 있는 배아를 72hpf에서 채취하면 대다수(~80%)는 2개월에^4mm2 이상의 멜라닌 세포 구조 영역이 하나 이상 있을 것입니다.
6. 매주 선택한 동물을 대상으로 종양의 존재 여부를 스크리닝합니다(그림 1B). 조직병리학적 변화와 형태학적 변화 사이에는 강한 상관관계가 있습니다. 양성에서 악성으로의 전환은 병변이 동물의 표면에서 올라갈 때 형태학적 변화로 인식됩니다. 연구를 위해 종양이 있는 동물을 분리하십시오.
7. 가로 좌표에 나이에 따른 흑색종이 없는 생존 곡선을 몇 주 안에 그리고 세로좌표에 흑색종이 없는 생존율을 그립니다. 관심 유전자를 발현하는 멜라닌 세포를 가진 동물을 멜라닌 세포에서 EGFP(향상된 녹색 형광 단백질)를 발현하는 대조 동물과 비교합니다(그림 1C). miniCoopR-EGFP를 주입한 동물의 종양 발병 중앙값은 약 18주입니다. 로그 순위 검정을 사용하여 두 곡선이 통계적으로 다른지 여부를 확인합니다.

그림 1. miniCoopR assay를 사용한 흑색종 발병 조절제 스크리닝. A) miniCoopR 분석의 개략도. miniCoopR 벡터와 관심 유전자를 포함하는 구조된 멜라닌 세포(화살촉)가 있는 배아. 눈금 막대 = 250μM. 4mm 이상의 성인2 멜라닌 세포 구조 (화살촉). 눈금 막대 = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP는 아멜라닌 및 색소 종양(화살촉)이 있는 제브라피쉬를 구조했습니다. C) 발암유전자 SETDB1과 대조군 EGFP 유전자를 발현하는 종양을 비교한 대표적인 흑색종이 없는 생존 곡선(p=9.4×10-7, log-rank χ2).