비늘 멜라닌 세포의 항체 염색 : 제브라 피시 모델의 등쪽 비늘 관련 멜라닌 세포에서 발현 된 전사 인자를 검출하는 기술

초록

출처: Sharanya Iyengar et al. 제브라피시 자가종양 모델을 사용한 흑색종 수정자 스크리닝. J. Vis. 특급 (2012년)

이 비디오는 제브라피시 모델의 등쪽 비늘 관련 멜라닌 세포에서 전사 인자 발현을 감지하는 항체 염색 방법을 설명합니다. 이 면역염색 기법은 형질전환 제브라피시에서 멜라닌세포 유도 형질주입 인자-A를 특이적으로 식별하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 스케일 멜라닌 세포의 항체 염색

1. 80 mL 0.1M Na₂HPO₄ 및 20 mL 0.1M NaH₂PO₄로 PO₄ 완충액을 구성한다. pH가 7.3인지 확인하십시오. 8.0g 슈크로스, 0.15mL 0.2M CaCl₂ 및 90mL 0.2M PO₄ 완충액, pH 7.3을 포함하는 2x fix buffer를 구성합니다. 필요한 경우 NaOH 또는 HCl로 pH를 7.3으로 조정한 다음 PO₄ 완충액으로 최대 100ml를 만듭니다.
2. 최대 300mg의 고체 PFA를 칭량하고 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. PFA의 4.5 x 질량(mg)과 동일한 부피에 5mM NaOH를 추가합니다(예: 450ul 5mM NaOH에서 100mg PFA). PFA가 용해될 때까지 가끔 흔들면서 60-70°C에서 가열합니다. 잔류 미립자를 스핀다운하고 PFA 상층액을 20% 회수합니다. 매번 신선하게 만드십시오.
3. 1x 고정 버퍼와 4% PFA를 함유한 고정 용액을 준비합니다.
4. 0.17mg/mL 트리카인으로 물고기를 마취합니다.
5. 해부 현미경으로 입사광을 사용하여 끝이 가는 날카롭고 끝이 가는 집게를 사용하여 등쪽 비늘을 뽑아내고 멜라닌 세포를 포함하는 비늘의 절반이 손상되지 않도록 주의합니다(그림 1A). 집게에서 직접 스케일을 1mL 고정 용액에 넣고 뒤집는 동안 실온에서 ≥ 2시간 동안 배양합니다. 물고기를 물고기 물에 옮기고 물고기를 모니터링하여 성공적인 회복을 확인하십시오.
6. 색소가 형성된 멜라닌 세포를 표백하려면 PBST(1x PBS pH 7.4, 0.1% Triton X-100)의 고정 스케일을 실온에서 5분 동안 2회 세척합니다. 0.4mL 10% KOH 및 0.15mL 30% H₂O₂를 함유한 갓 만든 표백제 용액 1ml를 dH₂O와 함께 5mL에 추가합니다. 가스가 튜브를 터뜨리는 것을 방지하기 위해 파라필름이나 캡 잠금 장치를 착용합니다. 색소가 사라질 때까지 표백을 계속합니다(일반적으로 10분).(그림 1B, C). PBST로 실온에서 5분 동안 4회 세탁합니다.
7. 1x PBS pH 7.4, 0.2% Triton X-100, 2mg/mL BSA, 1% DMSO, 0.02% NaN₃ 및 2% 양혈청으로 구성된 블록 용액에서 최소 30분 동안 차단합니다. HRP 반응으로 진행되는 경우 NaN₃ 를 생략하십시오.
8. 블록 용액에 1차 항체를 넣어 실온에서 밤새 배양합니다. 샘플이 물에 잠긴 상태로 유지되려면 샘플에 대해 최소 400μL의 용액이 있어야 합니다.
9. 실온의 PBST에서 30분 동안 저울을 3회 세척합니다.
10. 2차 항체와 함께 실온의 블록 용액에서 2시간에서 밤새 배양합니다.
11. PBST + 0.1 μM DAPI로 10분 동안 염색합니다.
12. PBST로 5분 동안 3회 세척합니다.
13. 벡타쉴드 한 방울의 유리 슬라이드에 저울을 장착하여 저울의 오목한 면이 슬라이드를 향해 아래를 향하도록 하고 그 위에 유리 덮개 슬립을 놓습니다. 투명한 매니큐어로 슬라이드의 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경(그림 1D, E, F, G)으로 슬라이드를 관찰합니다.

결과

그림 1. 스케일 멜라닌 세포의 항체 염색. A) 마취된 miniCoopR-EGFP 제브라피시에서 비늘을 뽑는 것. B) 색소가 있는 멜라닌 세포가 있는 표백되지 않은 비늘 및 C) miniCoopR-EGFP 제브라피쉬의 표백 비늘. 스케일 바 = 100μM. D) Mitfa 항체 및 E) DAPI로 염색된 표백되지 않은 스케일. F) Mitfa 항체 및 G) DAPI로 염색된 표백 스케일. 스케일 바 = 40μM.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
게이트웨이 재조합 시약	인비트로젠
미니쿠프
Mitfa 항체
FITC 염소 항토끼 IgG 항체	인비트로젠
벡타쉴드	벡터 랩스	H-1000
캐스퍼 제브라피시
701N 10μl 실린지	해밀턴/피셔	제14-824
FBS(증권 시세	인비트로젠	26140079

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