피하 이식 분석: 기증자에서 수혜자에게 흑색종 세포를 이식하는 방법 제브라피시 모델

초록

출처: Iyengar, S. et al. 제브라피시 자가종양 모델을 사용한 흑색종 수정자 스크리닝. 특급(2012)

이 비디오는 흑색종 보유 기증자 제브라피시 모델에서 면역이 저하된 수혜자 캐스퍼 제브라피시로 종양 세포를 이식하는 방법을 설명합니다. 수용 물고기의 종양 생착 및 증식을 시각화하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 이식 분석

1. 이식 하루 전에 25Gy의 감마선을 조사하여 수혜자 2-3개월 된 캐스퍼 물고기를 준비합니다. 물고기가 물고기 물에서 회복할 수 있도록 합니다.
2. 기관 지침에 따라 종양을 가진 물고기를 안락사시킵니다. 구체적으로 말하자면, 아가미 움직임이 멈출 때까지 0.6mg/mL 트리카인이 함유된 접시에 생선을 넣습니다.
3. 종양을 잘라내고 약 5mL 필터와 함께 페트리 접시에 넣고 0.9x PBS와 5% FBS를 멸균합니다. 용액에 있는 동안 면도기로 종양을 깍둑썰기합니다.
4. 실온에서 작업하고 P1000 피펫으로 분쇄하여 단일 세포를 얻습니다. 5% FBS로 멸균된 0.9x PBS 필터로 부피를 25mL로 구성합니다.
5. 40μM 메쉬 필터를 통해 필터링합니다.
6. Eppendorf 5810R 테이블탑 원심분리기를 1,500 rpm (453 rcf)으로 10분 동안 회전시킵니다.
7. 상층액을 제거하고 세포 현탁액을 대략 원하는 농도로 만듭니다(100mm³ 종양에 대해 10⁷ 세포 가정).
8. 혈구계를 사용하여 정확한 세포 수를 계산하고 최종 주입량이 약 5μL가 되도록 세포 현탁액을 희석합니다. 예를 들어, 50,000개의 세포를 주입해야 하는 경우 세포 현탁액을 10,000 cells/μL의 최종 농도로 희석해야 합니다. 세포 현탁액이 들어 있는 튜브를 몇 분마다 튕겨 세포가 뭉치는 것을 방지합니다.
9. 26s 게이지(베벨 팁) 701 N 10 μL Hamilton 주사기를 100% 에탄올과 0.9x PBS로 2-3회 세척합니다. 주사기에 5μL의 세포 현탁액을 로드합니다.
10. 방사선 조사된 수혜자 물고기를 0.17mg/mL 트리카인으로 마취합니다. 광고에 물고기를 옆으로 눕히십시오.amp Kimwipe(그림 1A).
11. 한 손으로 물고기를 안정시키고 경사가 위를 향하도록 바늘을 45° 각도로 위쪽을 향하게 하여 후뇌의 후방 경계와 등지느러미의 전방 경계 사이의 약 중간 지점인 복막강 위의 물고기 측면에 삽입합니다.플런저를 부드럽게 누릅니다(그림 1B).
12. 물고기가 민물고기 물에서 회복되도록 하고 종양 생착이 있는지 매일 물고기를 관찰합니다(그림 1C). 생착이 발생한 경우 지속적인 성장과 질병 발생도 관찰할 수 있습니다.

결과

그림 1. 흑색종 세포의 이식. A) 주입되지 않은 캐스퍼 제브라피시. 스케일 바 = 500 μM. B) 50,000개의 흑색종 세포를 주입한 직후 방사선 조사된 캐스퍼 수혜자에 대한 피하 이식 부위(화살촉). 눈금 막대 = 200 μM. C) 50,000 흑색종 세포를 주입 2 주 후 종양 생착 (화살촉)을 보여주는 Casper 방사선 조사.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
게이트웨이 재조합 시약	인비트로젠
미니쿠프
캐스퍼 제브라피시
701N 10μl 실린지	해밀턴/피셔	제14-824
40μM 필터	BD 팔콘/피셔	352340
FBS(증권 시세	인비트로젠	26140079

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