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1. 배지 및 시약의 준비
- L-아스코르브산 2-인산염 원료 200배 준비
- Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium) 용액 5mL당 29mg의 L-아스코르브산 2-인산염을 용해하고 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 여과합니다. -20 °C에서 0.25 mL 멸균 부분 표본으로 보관하십시오.
- 필요한 날에 50mL의 섬유아세포 배지(1% L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM)마다 200x L-아스코르브산 2-인산염 스톡 0.25mL 분취액을 추가하여 최종 농도 0.1mM의 L-아스코르브산 2-인산염
을 얻습니다.
- 각질 세포 성장 배지의 제조
- 원발성 편평세포암(primary squamous cell carcinoma, SCC) 각질세포의 분리 및 배양은 이전에 기술된 바 있다. 각질세포 성장 배지의 제조도 여기에 기재되어 있습니다.
- 간단히 다음과 같이 미디어를 준비합니다.
DMEM 300mL 및 Ham's F-12 100mL에 10% FBS
보충
0.4 mg/mL 하이드로코르티손
인슐린 5mg/mL
10ng/mL EGF
5 mg/mL 트랜스퍼린
8.4ng/mL 콜레라 독소
13ng/mL 리오티로닌
1x 페니실린-스트렙토마이신 용액
2. L-아스코르브산 2-인산염 보충 배지에서 섬유아세포 유래 네이티브 매트릭스의 시험관 내 구축
- L-아스코르브산 2-인산염이 보충된 섬유아세포 배지의 6-웰 플레이트(20,000 cells/cm2)에 웰당 200,000개의 섬유아세포를 파종합니다. 2-3일마다 2-5mL의 배지를 재공급합니다. (참고: 재공급 빈도와 양은 다른 세포의 개별 요구에 맞게 조정될 수 있습니다.)
- 세포외 기질에 내장된 두꺼운 세포층은 6주가 지나면 형성되어 육안으로 볼 수 있습니다(그림 1). 조직 배양 플레이트에서 이 층을 분리하려면 1mL 마이크로피펫 팁으로 매트릭스 둘레를 부드럽게 긁어낸 다음 매트릭스의 가장자리를 웰 중앙 쪽으로 밉니다. 이 세포층과 매트릭스(네이티브 매트릭스)는 플레이트 표면에서 쉽게 분리할 수 있어야 하며 이제 매체에 떠 있어야 합니다. 네이티브 매트릭스를 미디어에 펼쳐서 자체로 접히지 않도록 합니다.
- 기본 매트릭스를 5일 동안 띄우고 리모델링하고 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 매트릭스 내의 인장 강도와 고유 리모델링으로 인해 매트릭스는 급격히 수축하고 더 작지만 더 두꺼운 네이티브 매트릭스로 축소되어 침입 분석에 사용할 준비가 됩니다.
3. 종양 SCC 각질세포를 이용한 침입 분석
- 뭉툭한 집게로 기본 매트릭스를 부드럽게 잡고 나일론 그물로 옮깁니다. 나일론 그물에 올려 놓으면 1mL 마이크로 피펫 팁과 뭉툭한 집게를 사용하여 매트릭스를 부드럽게 펴서 가능한 한 평평하게 놓습니다.
- 한쪽 끝에 소량의 멸균 바셀린을 도포하여 멸균 클론 실린더를 준비합니다.
- 클론 실린더를 기본 매트릭스에 놓고 바셀린 면이 아래로 향하게 합니다. 이것은 네이티브 매트릭스와 클론 고리 사이의 단단한 밀봉을 보장하기 위한 것입니다.
- 클론 실린더(100μl의 각질 세포 성장 배지에 있는 250,000개의 세포)에 cSCC 세포를 추가합니다.
- cSCC 세포가 native matrix에 정착한 후 6시간 후에 클론 실린더를 제거합니다.
- 기본 매트릭스 및 cSCC 셀이 있는 나일론 그물을 구부러진 스테인리스 스틸 와이어 메쉬 지지대의 공기-액체 인터페이스로 들어 올립니다.
- 배지 수준이 네이티브 매트릭스의 바닥에 닿을 때까지 아스코르브산이 보충된 각질 세포 성장 배지를 추가합니다.
- 2-3일마다 배지를 교체하고 cSCC 세포의 파종 후 7일과 14일에 수확합니다.
