종양 세포 침입 분석: 상피-중간엽 세포 상호 작용을 평가하기 위한 3D 체외 네이티브 매트릭스 기반 방법

1. 배지 및 시약의 준비

1. L-아스코르브산 2-인산염 원료 200배 준비
   1. Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium) 용액 5mL당 29mg의 L-아스코르브산 2-인산염을 용해하고 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 여과합니다. -20 °C에서 0.25 mL 멸균 부분 표본으로 보관하십시오.
   2. 필요한 날에 50mL의 섬유아세포 배지(1% L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM)마다 200x L-아스코르브산 2-인산염 스톡 0.25mL 분취액을 추가하여 최종 농도 0.1mM의 L-아스코르브산 2-인산염
   을 얻습니다.
2. 각질 세포 성장 배지의 제조
   1. 원발성 편평세포암(primary squamous cell carcinoma, SCC) 각질세포의 분리 및 배양은 이전에 기술된 바 있다. 각질세포 성장 배지의 제조도 여기에 기재되어 있습니다.
   2. 간단히 다음과 같이 미디어를 준비합니다.
      DMEM 300mL 및 Ham's F-12 100mL에 10% FBS
      보충 0.4 mg/mL 하이드로코르티손
      인슐린 5mg/mL
      10ng/mL EGF
      5 mg/mL 트랜스퍼린
      8.4ng/mL 콜레라 독소
      13ng/mL 리오티로닌
      1x 페니실린-스트렙토마이신 용액

2. L-아스코르브산 2-인산염 보충 배지에서 섬유아세포 유래 네이티브 매트릭스의 시험관 내 구축

1. L-아스코르브산 2-인산염이 보충된 섬유아세포 배지의 6-웰 플레이트(20,000 cells/cm²)에 웰당 200,000개의 섬유아세포를 파종합니다. 2-3일마다 2-5mL의 배지를 재공급합니다. (참고: 재공급 빈도와 양은 다른 세포의 개별 요구에 맞게 조정될 수 있습니다.)
2. 세포외 기질에 내장된 두꺼운 세포층은 6주가 지나면 형성되어 육안으로 볼 수 있습니다(그림 1). 조직 배양 플레이트에서 이 층을 분리하려면 1mL 마이크로피펫 팁으로 매트릭스 둘레를 부드럽게 긁어낸 다음 매트릭스의 가장자리를 웰 중앙 쪽으로 밉니다. 이 세포층과 매트릭스(네이티브 매트릭스)는 플레이트 표면에서 쉽게 분리할 수 있어야 하며 이제 매체에 떠 있어야 합니다. 네이티브 매트릭스를 미디어에 펼쳐서 자체로 접히지 않도록 합니다.
3. 기본 매트릭스를 5일 동안 띄우고 리모델링하고 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 매트릭스 내의 인장 강도와 고유 리모델링으로 인해 매트릭스는 급격히 수축하고 더 작지만 더 두꺼운 네이티브 매트릭스로 축소되어 침입 분석에 사용할 준비가 됩니다.

3. 종양 SCC 각질세포를 이용한 침입 분석

1. 뭉툭한 집게로 기본 매트릭스를 부드럽게 잡고 나일론 그물로 옮깁니다. 나일론 그물에 올려 놓으면 1mL 마이크로 피펫 팁과 뭉툭한 집게를 사용하여 매트릭스를 부드럽게 펴서 가능한 한 평평하게 놓습니다.
2. 한쪽 끝에 소량의 멸균 바셀린을 도포하여 멸균 클론 실린더를 준비합니다.
3. 클론 실린더를 기본 매트릭스에 놓고 바셀린 면이 아래로 향하게 합니다. 이것은 네이티브 매트릭스와 클론 고리 사이의 단단한 밀봉을 보장하기 위한 것입니다.
4. 클론 실린더(100μl의 각질 세포 성장 배지에 있는 250,000개의 세포)에 cSCC 세포를 추가합니다.
5. cSCC 세포가 native matrix에 정착한 후 6시간 후에 클론 실린더를 제거합니다.
6. 기본 매트릭스 및 cSCC 셀이 있는 나일론 그물을 구부러진 스테인리스 스틸 와이어 메쉬 지지대의 공기-액체 인터페이스로 들어 올립니다.
7. 배지 수준이 네이티브 매트릭스의 바닥에 닿을 때까지 아스코르브산이 보충된 각질 세포 성장 배지를 추가합니다.
8. 2-3일마다 배지를 교체하고 cSCC 세포의 파종 후 7일과 14일에 수확합니다.

그림 1. 섬유아세포 유래 네이티브 매트릭스 생성 및 종양 침습 분석의 워크플로우.