이 문서 유동세포계측법를 사용하여 고정하고 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정하기위한 세부 프로토콜을 것입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Calpains는 유비 쿼터스 세포, 칼슘 구분, 중립 시스테인 프로 테아제 아르
프로토콜
시약 준비
참고 : 모든 PBS는 칼슘 2 +와 MG 2가 포함되어 +
- 탐지 시약
방 온도를 PBS로 20μM 7 - 아미노 - 4 - chloromethyl coumarin, T - BOC - 류신 - 메티오닌 아미드를 (BOC - LM - CMAC) 추가합니다. 각각의 세포 현탁액은 2mL 탐지 시약을 필요로합니다. - 1 % Paraformaldehyde (고정 세포)
방 온도를 PBS에 4 % paraformaldehyde 주식 솔루션을 희석. 각 외과 튜브로 나누어지는 1mL 1 % paraformaldehyde. 쓰리 외과 튜브 각 실험 조건이 필요합니다 (예 : 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit가 + PD98059 9 외과 튜브가 필요) - PD150606 (calpain 억제제)
100mM의 최종 농도로 DMSO에 PD150606 Reconstitute. 이 시약이 실험 기간 동안 빛으로부터 그것으로 취급 모든 세포를 보호할 수 있습니다. - PD98059 (MEK1 억제제)
50mM의 최종 농도로 DMSO에 Reconstitute PD9805....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
고정 생활 32Dkit 세포의 calpain 활동이 비디오 프로토콜에서 결정되었습니다. calpain 억제제 PD150606과 세포 라인의 치료는 세포의 calpain 활동의 완전한 억제 결과. 또한, MEK1 억제제 PD98059 치료는 세포의 calpain 활동의 완전한 억제 결과. ERK는 calpain - 2 3의 주요 활성입니다. 이러한 결과는 calpain - 2 활동이 32Dkit 세포의 지배는 것이 좋습니다. 우리 연구실에서 현재 작업 증가 calpain 활동의 결과와 백혈병에 calpain - 1 calpain - 2의 기여를 조사하고있다.
이 프로토콜 세부 고정 및 살아있는 세포에서 calpain 활동 수준을 측정하는 최초의 흐름 cytometric 분석을 기반으로하며 calpain 규정하고 그대로 세포를 사용하여 병적인 과정에서 그 역할의 메커니즘을 이해하는 데 사용할 수 있습니다.
이.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
건강 연구, 백혈병과 림프종 사회 캐나다와 캐나다의 림프종 재단의 캐나다 연구소에서 교부금에 의해 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% 파라포름알데히드 | Invitrogen | 4g의 파라포름알데히드를 100mL의 PBS에 녹인다. 흄 후드 내에서 시료가 투명해질 때까지 교반하며 가열한다. 식힌 후 4°C에서 보관하십시오.°C | |
| PD150606 | Invitrogen | 최대의 칼파인(calpain) 억제 효과를 위해 갓 재구성한 PD150606을 사용하십시오. | |
| PD98059 | Cell Signaling Technology | ||
| AlignFlow, 형광 비드 포함 AlignFlow plus FACS 튜브 | Invitrogen | ||
| LSR II | BD Biosciences | 본 실험에서는 WEHI-3 세포의 상층액을 IL-3 공급원으로 사용합니다. 32Dkit 세포 성장에 사용될 최적 농도를 결정하기 위해 수집된 각 WEHI-3 상층액의 역가를 측정합니다. |
참고문헌
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
